課題2土壤中分解尿素(niàosù)的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)課題2微生物的培養(yǎng)(péiyǎng)與應(yīng)用第一頁(yè)，共三十八頁(yè)。一、課題(kètí)背景1、尿素(niàosù)的利用尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥(dànféi)。尿素不能直接被農(nóng)作物吸收。土壤中的細(xì)菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、細(xì)菌利用尿素的原因土壤中的細(xì)菌分解尿素是因?yàn)樗鼈兡芎铣呻迕窩O(NH2)2脲酶+CO2NH3+H2O第二頁(yè)，共三十八頁(yè)。3、常見(chánɡjiàn)的分解尿素的微生物芽孢桿菌(gǎnjūn)、小球菌、假單胞桿菌(gǎnjūn)、克氏桿菌(gǎnjūn)、棒狀桿菌(gǎnjūn)、梭狀芽孢桿菌(gǎnjūn)，某些真菌和放線菌也能分解尿素。4、課題(kètí)目的①?gòu)耐寥乐蟹蛛x出能夠分解尿素的細(xì)菌②統(tǒng)計(jì)每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細(xì)菌一.研究思路㈠.篩選菌株㈡.統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目㈢.設(shè)置對(duì)照第三頁(yè)，共三十八頁(yè)。

1、實(shí)例(shílì)：?jiǎn)⑹荆簩ふ夷康木N時(shí)要根據(jù)它對(duì)生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)(xiāngyīng)的環(huán)境中去尋找。問(wèn)：如果(rúguǒ)請(qǐng)你尋找這種耐高溫的酶，你會(huì)去哪里尋找？

DNA多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種在體外將少量DNA大量復(fù)制的技術(shù)，此項(xiàng)技術(shù)要求使用耐高溫的DNA聚合酶（930C）。㈠.篩選菌株第四頁(yè)，共三十八頁(yè)。問(wèn)：為什么Taq細(xì)菌(xìjūn)能從熱泉中被篩選出來(lái)？

水生耐熱細(xì)菌Taq：美國(guó)科學(xué)家布魯克于1966年在美國(guó)黃石國(guó)家(guójiā)公園的一個(gè)熱泉中發(fā)現(xiàn)，并分離出耐高溫的TaqDNA聚合酶。第五頁(yè)，共三十八頁(yè)。原因：因?yàn)闊崛獪囟?0～800C，高溫(gāowēn)淘汰了絕大多數(shù)微生物（不耐熱），只有Taq細(xì)菌被篩選出來(lái)?！狙芯?yánjiū)思路】

（一）篩選(shāixuǎn)菌株原理：人為提供有利于目的菌株生長(zhǎng)的條件（包括營(yíng)養(yǎng)、溫度、PH等），同時(shí)抑制或阻止其他微生物生長(zhǎng)。有選擇作用第六頁(yè)，共三十八頁(yè)。

要分離一種微生物，必須根據(jù)該微生物的特點(diǎn)，包括營(yíng)養(yǎng)、生理、生長(zhǎng)條件等；配置合適的培養(yǎng)基方法：⑴抑制(yìzhì)大多數(shù)微生物生長(zhǎng)⑵造成有利于該菌生長(zhǎng)的環(huán)境，結(jié)果：培養(yǎng)一定時(shí)間后，該菌數(shù)量上升，再通過(guò)稀釋涂布平板法等方法對(duì)它進(jìn)行純化培養(yǎng)分離。2、實(shí)驗(yàn)室中微生物的篩選(shāixuǎn)原理：第七頁(yè)，共三十八頁(yè)。15.0g瓊脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO43、土壤中分解(fēnjiě)尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)所需培養(yǎng)基：①?gòu)奈锢硇再|(zhì)(wùlǐxìngzhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類？從功能上屬于哪類培養(yǎng)基？固體(gùtǐ)培養(yǎng)基②在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源？碳源：葡萄糖、尿素

氮源：尿素選擇培養(yǎng)基第八頁(yè)，共三十八頁(yè)。培養(yǎng)基的氮源為尿素，只有能合成脲酶的微生物才能利用尿素作為氮源而生存。

缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生長(zhǎng)發(fā)育繁殖，而受到抑制，所以(suǒyǐ)用此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物。4、該培養(yǎng)基如何將分解尿素(niàosù)的細(xì)菌選擇出來(lái)？選擇培養(yǎng)基：在微生物學(xué)中，將允許特定種類(zhǒnglèi)的微生物生長(zhǎng)，同時(shí)抑制或阻止其他種類(zhǒnglèi)微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。第九頁(yè)，共三十八頁(yè)。組別培養(yǎng)基類型是否涂布接種目的實(shí)驗(yàn)組以尿素為唯一氮源的選擇性培養(yǎng)基是對(duì)照組牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是分離尿素(niàosù)細(xì)菌用以判斷(pànduàn)選擇性培養(yǎng)基是否具有選擇性對(duì)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)(shíyàn)的訓(xùn)練第十頁(yè)，共三十八頁(yè)。

對(duì)照組牛肉(niúròu)膏蛋白胨培養(yǎng)基

實(shí)驗(yàn)組以尿素(niàosù)為氮源的培養(yǎng)基第十一頁(yè)，共三十八頁(yè)?！窘y(tǒng)計(jì)(tǒngjì)菌落數(shù)目】常用方法：稀釋涂布平板法、顯微鏡直接計(jì)數(shù)法，還可以(kěyǐ)用過(guò)濾膜法1、稀釋(xīshì)涂布平板法（也叫活菌計(jì)數(shù)法）（1）原理：當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的一個(gè)菌落，來(lái)源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌，通過(guò)統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，就能推測(cè)出樣品中大約含有多少活菌。

1個(gè)菌落=1個(gè)活菌

第十二頁(yè)，共三十八頁(yè)。稀釋(xīshì)涂布平板法。（2）操作方法：稀釋涂布平板→統(tǒng)計(jì)(tǒngjì)菌落數(shù)。（3）統(tǒng)計(jì)原則①、選30—300個(gè)菌落的平板統(tǒng)計(jì)。②、每個(gè)稀釋度取3個(gè)平板取其平均值。（4）統(tǒng)計(jì)結(jié)果：統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低，因此(yīncǐ)統(tǒng)計(jì)結(jié)果一般用菌落數(shù)來(lái)表示。第十三頁(yè)，共三十八頁(yè)。同學(xué)平板1平板2平板3平均數(shù)評(píng)價(jià)甲230230乙21212256163結(jié)論啟示沒有設(shè)置重復(fù)組，因此結(jié)果(jiēguǒ)不具說(shuō)服力。1個(gè)平板的計(jì)數(shù)結(jié)果與另2個(gè)相差(xiānɡchà)太遠(yuǎn)，說(shuō)明在操作過(guò)程中可能出現(xiàn)了錯(cuò)誤。不能簡(jiǎn)單地將3個(gè)平板的計(jì)數(shù)值(shùzí)用來(lái)求平均值。在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)，一定要涂布至少3個(gè)平板，作為重復(fù)組，才能增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的說(shuō)服力與準(zhǔn)確性。在分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)，一定要考慮所設(shè)置的重復(fù)組的結(jié)果是否一致，結(jié)果不一致，意味著操作有誤，需要重新實(shí)驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目P22第十四頁(yè)，共三十八頁(yè)。注意事項(xiàng)①為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30——300的平板上進(jìn)行計(jì)數(shù)。②為使結(jié)果接近真實(shí)值可將同一稀釋度加到三個(gè)或三個(gè)以上的平皿中，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計(jì)算出菌落平均數(shù)。③統(tǒng)計(jì)的菌落往往(wǎngwǎng)比活菌的實(shí)際數(shù)目低。④涂布平板法所選擇的稀釋度很重要，一般以三個(gè)稀釋度中的第二個(gè)稀釋度所出現(xiàn)的平均菌落數(shù)在50個(gè)左右為最好。第十五頁(yè)，共三十八頁(yè)。（三）設(shè)置(shèzhì)對(duì)照在做本課題的實(shí)驗(yàn)時(shí)，A同學(xué)從對(duì)應(yīng)106倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約150個(gè)菌落。但是，其他同學(xué)在同樣的稀釋度下只選擇出大約50個(gè)菌落。其他同學(xué)認(rèn)為A同學(xué)的結(jié)果有問(wèn)題。他們分析可能是A同學(xué)的培養(yǎng)基被雜菌污染(wūrǎn)了，或者培養(yǎng)基中混入了其他含氮物質(zhì)，因而導(dǎo)致不能分解尿素的細(xì)菌也能在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。但是，A同學(xué)確信自己的實(shí)驗(yàn)操作準(zhǔn)確無(wú)誤，與其他同學(xué)的結(jié)果之所以不相同，是因?yàn)樽约核x用的土壤樣品不同。但是，A同學(xué)在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的時(shí)候并沒有設(shè)置對(duì)照，因而此時(shí)也拿了不出令人信服的證據(jù)。你能通過(guò)設(shè)置對(duì)照，幫助A同學(xué)學(xué)排除上述兩個(gè)可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素嗎？第十六頁(yè)，共三十八頁(yè)。設(shè)置對(duì)照的主要目的是排除實(shí)驗(yàn)組中非測(cè)試因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響(yǐngxiǎng)，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。㈢.設(shè)置(shèzhì)對(duì)照：設(shè)置對(duì)照(duìzhào)的方法：空白對(duì)照：不給對(duì)照組任何處理因素。條件對(duì)照：給對(duì)照組施以部分實(shí)驗(yàn)因素，但不是所要研究的處理因素。自身對(duì)照：對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組都在同一研究對(duì)象上進(jìn)行。相互對(duì)照：不單設(shè)對(duì)照組，而是幾個(gè)實(shí)驗(yàn)組相互對(duì)照。A同學(xué)的結(jié)果與其他同學(xué)不同，可能的解釋有兩種。一是由于土樣不同；二是由于培養(yǎng)基污染或操作失誤。第十七頁(yè)，共三十八頁(yè)。小結(jié)：通過(guò)(tōngguò)這個(gè)事例可以看出，實(shí)驗(yàn)結(jié)果要有說(shuō)服力，對(duì)照的設(shè)置是必不可少的。方案(fāngàn)一：由其他同學(xué)用與A同學(xué)相同土樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)

方案二：將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為(zuòwéi)空白對(duì)照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。結(jié)果預(yù)測(cè)：如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明A無(wú)誤；如果結(jié)果不同，則證明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問(wèn)題。第十八頁(yè)，共三十八頁(yè)。二.實(shí)驗(yàn)的具體操作

㈠.土壤取樣

從肥沃、濕潤(rùn)的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中?！羧⊥翗佑玫男¤F鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。㈡.制備培養(yǎng)基：制備以尿素(niàosù)為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基。第十九頁(yè)，共三十八頁(yè)。◆應(yīng)在火焰旁稱取土壤10g?！粼谙♂屚寥廊芤旱倪^(guò)程(guòchéng)中，每一步都要在火焰旁進(jìn)行◆分離(fēnlí)不同的微生物采用不同的稀釋度原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保證獲得菌落數(shù)在30～300之間、適于計(jì)數(shù)的平板[三]樣品(yàngpǐn)的稀釋第二十頁(yè)，共三十八頁(yè)。微生物的種類土壤稀釋倍數(shù)目標(biāo)分離土壤中所有細(xì)菌104、105、106平板上的菌落數(shù)應(yīng)為30～300個(gè)，便于準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。分離土壤中的放線菌103、104、105分離土壤中的真菌102、103、104分離土壤中的尿素細(xì)菌104、105、106、107（二）土壤(tǔrǎng)稀釋二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)第二十一頁(yè)，共三十八頁(yè)。10110210310410510610710g土壤9ml無(wú)菌水9ml無(wú)菌水1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml104104104105105105106106106107107107稀釋涂布平板法第二十二頁(yè)，共三十八頁(yè)。㈣.取樣(qǔyàng)涂布◆如果得到了2個(gè)或2個(gè)以上菌落數(shù)目在30——300的平板，則說(shuō)明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)，如果同一稀釋倍數(shù)的三個(gè)重復(fù)的菌落數(shù)相差較大，表明試驗(yàn)不精確，需要(xūyào)重新實(shí)驗(yàn)。第二十三頁(yè)，共三十八頁(yè)。㈤.微生物的培養(yǎng)(péiyǎng)與觀察在菌落計(jì)數(shù)時(shí)，每隔24h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目。選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果，以防止因培養(yǎng)(péiyǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。培養(yǎng)不同(bùtónɡ)微生物往往需要不同(bùtónɡ)培養(yǎng)溫度。細(xì)菌：30～37℃培養(yǎng)1～2d放線菌：25～28℃培養(yǎng)5～7d霉菌：25～28℃的溫度下培養(yǎng)3～4d。第二十四頁(yè)，共三十八頁(yè)。微生物的培養(yǎng)(péiyǎng)與觀察第二十五頁(yè)，共三十八頁(yè)。三.結(jié)果分析與評(píng)價(jià)1.通過(guò)對(duì)照實(shí)驗(yàn)，若培養(yǎng)物有雜菌污染，菌落數(shù)偏高；若培養(yǎng)物混入其他氮源，則菌落形態(tài)多樣(duōyànɡ)，菌落數(shù)偏高，難以選擇出分解尿素的微生物。2.提示：選擇每個(gè)平板上長(zhǎng)有30—300個(gè)菌落的稀釋倍計(jì)算每克樣品的菌數(shù)最合適。同一稀釋倍數(shù)的三個(gè)重復(fù)的菌落數(shù)不能相差懸殊，如相差較大，表示實(shí)驗(yàn)不精確。第二十六頁(yè)，共三十八頁(yè)。大小、形狀（圓形，假根狀，不規(guī)則狀）表面(biǎomiàn)特征（光滑，皺縮，顆粒狀，龜裂狀，同心圓狀）隆起形狀（擴(kuò)展，臺(tái)狀，凹面，凸面，乳頭狀）邊緣情況（整齊，波狀，裂葉狀，鋸齒狀）表面光澤（無(wú)光澤，金屬光澤，閃光）質(zhì)地（油脂狀，膜狀，粘脆）顏色、透明度第二十七頁(yè)，共三十八頁(yè)。四、操作(cāozuò)提示

無(wú)菌操作(cāozuò)

做好標(biāo)記(biāojì)

規(guī)劃時(shí)間

第二十八頁(yè)，共三十八頁(yè)。五.課外延伸

在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果PH升高(shēnɡɡāo)，指示劑將變紅，說(shuō)明該細(xì)菌能夠分解尿素。測(cè)定(cèdìng)飲水中大腸桿菌數(shù)量的方法是將一定體積的水用細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾后，將濾膜放到伊紅——美藍(lán)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，大腸桿菌菌落呈現(xiàn)深紫色，并且有金屬光澤，通過(guò)記述得出水樣中大腸桿菌的數(shù)量。第二十九頁(yè)，共三十八頁(yè)。大腸桿菌(dàchánɡɡǎnjūn)呈黑色中心,有或無(wú)金屬光澤大腸桿菌在伊紅美藍(lán)瓊脂(EMB)上典型(diǎnxíng)特征

第三十頁(yè)，共三十八頁(yè)。本課題知識(shí)(zhīshi)小結(jié):第三十一頁(yè)，共三十八頁(yè)。六、例題(lìtí)解析

例1．對(duì)細(xì)菌群體生長(zhǎng)規(guī)律測(cè)定的正確的表述是

A．在液體培養(yǎng)基上進(jìn)行

B．至少接種(jiēzhòng)一種細(xì)菌

C．接種一個(gè)細(xì)菌

D．及時(shí)補(bǔ)充消耗的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)解析：細(xì)菌群體生長(zhǎng)規(guī)律的測(cè)定是人們?cè)谝欢l件下進(jìn)行的。這些(zhèxiē)條件是：一種細(xì)菌、恒定容積的培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基、定時(shí)測(cè)定細(xì)菌總數(shù)。在這些條件下，才能測(cè)定出細(xì)菌的生長(zhǎng)規(guī)律。測(cè)定時(shí)只能用一種細(xì)菌的子細(xì)胞群體的變化規(guī)律表達(dá)微生物的生長(zhǎng)；恒定容積是給微生物提供一定的生存環(huán)境；液體培養(yǎng)基才能通過(guò)樣品推測(cè)細(xì)菌總數(shù)。若接種多種細(xì)菌，則會(huì)發(fā)生種間斗爭(zhēng)而不能測(cè)定一種微生物的生長(zhǎng)規(guī)律。在接種時(shí)，要保證一定的接種量。答案：A第三十二頁(yè)，共三十八頁(yè)。例2．在微生物群體生長(zhǎng)規(guī)律的測(cè)定中，種內(nèi)斗爭(zhēng)最顯著(xiǎnzhù)最激烈的時(shí)期是

A．調(diào)整期B．對(duì)數(shù)期

C．穩(wěn)定期D．衰亡期

解析：種內(nèi)斗爭(zhēng)是一種生態(tài)因素。種內(nèi)斗爭(zhēng)反應(yīng)了種內(nèi)生物對(duì)生存空間和生活資源的爭(zhēng)奪。在生活空間充裕，營(yíng)養(yǎng)充足的時(shí)候，種內(nèi)斗爭(zhēng)的程度是比較低的。隨著微生物個(gè)體數(shù)目(shùmù)的增加，每個(gè)個(gè)體的生存空間越來(lái)越少，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也越來(lái)越少，每個(gè)個(gè)體對(duì)生存空間和資源的爭(zhēng)奪也越來(lái)越激烈，種內(nèi)斗爭(zhēng)就越來(lái)越激烈。由此可知，在穩(wěn)定期的種內(nèi)斗爭(zhēng)最激烈。在衰亡期，微生物的數(shù)目已經(jīng)開始減少，pH已經(jīng)極度不適于微生物的生存，次級(jí)代謝產(chǎn)物積累到很高的程度，這時(shí)的微生物的生存斗爭(zhēng)主要是與無(wú)機(jī)環(huán)境的斗爭(zhēng)。答案(dáàn)：C第三十三頁(yè)，共三十八頁(yè)。1.對(duì)細(xì)菌群體生長(zhǎng)規(guī)律測(cè)定的正確的表述是（）

A.在液體培養(yǎng)基上進(jìn)行B.至少接種一種細(xì)菌

C.接種一個(gè)細(xì)菌D.及時(shí)補(bǔ)充消耗的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)2.使用選擇培養(yǎng)基的目的是（）

A.培養(yǎng)細(xì)菌

B.培養(yǎng)真菌

C.使需要的微生物大量繁殖

D.表現(xiàn)某微生物的特定性狀與其他微生物加以區(qū)別(qūbié)3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分別是()A.CO2和N2B.葡萄糖和NH3

C.CO2和尿素D.葡萄糖和尿素實(shí)踐(shíjiàn)訓(xùn)練A

CD第三十四頁(yè)，共三十八頁(yè)。4.下列說(shuō)法不正確的是（）

A.科學(xué)家從70－80度熱泉中分離到耐高溫的TaqDNA聚合酶

B.統(tǒng)計(jì)某一稀釋度的5個(gè)平板的菌落數(shù)依次為M1、M2、M3、M4、M5，以M3作為該樣品菌落數(shù)的估計(jì)值

C.設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)的主要目的是排除(páichú)實(shí)驗(yàn)組中非測(cè)試因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度

D.同其他生物環(huán)境相比，土壤中的微生物數(shù)量最大，種類最多。5.為培養(yǎng)和分離出酵母菌并淘汰雜菌，常在培養(yǎng)基中加入（）

A.較多的氮源物質(zhì)B.較多的碳源物質(zhì)

C.青霉素