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DB22吉 林 省 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB22/T3366—2022牛中華泰勒蟲病檢測(cè)PCRPCRdetectionoftheileriasinensisinbovine20222022051820220608吉林省市場(chǎng)監(jiān)督管理廳發(fā)布DB22/T3366DB22/T3366—2022前 言GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別這些專利的責(zé)任。本文件由吉林省畜牧業(yè)管理局提出并歸口。導(dǎo)中心、延邊朝鮮族自治州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、延邊朝鮮族自治州畜牧總站。肖玉海。IIDB22/T3366DB22/T3366—2022DB22/T3366—20224.1.104.1.114.1.12DB22/T3366—20224.1.104.1.114.1.124.1.13A.6。質(zhì)DNABDNA質(zhì)粒DNA提取試劑盒。4.2引物PCR反應(yīng)引物序列與濃度見表1。表1PCR牛中華泰勒蟲病檢測(cè)PCR法范圍本文件規(guī)定了牛中華泰勒蟲病PCR檢測(cè)方法的試劑或材料、儀器設(shè)備、樣品、試驗(yàn)步驟、結(jié)果判定和廢棄物處理。本文件適用于牛中華泰勒蟲核酸檢測(cè)。規(guī)范性引用文件（包括所有的修改單適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求NY/T541 獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范3術(shù)語和定義3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1中華泰勒蟲病theileriasinensis中華泰勒蟲(Theileriasinensis)寄生于牛的紅細(xì)胞和白細(xì)胞中，以發(fā)熱、貧血、黃疸及體表淋巴結(jié)腫大為典型癥狀的一種蜱傳播性血液原蟲病。4試劑或材料除另有規(guī)定，所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水符合GB/T6682中一級(jí)水的要求。試劑或材料DNAdNTP（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）。TaqDNADNAMarker50×TAEA.1。A.2。10mg/mLA.3。1%A.4。A.5。1引物引物序列參考序列長度bp濃度pmol/μLP15′-CACTGCTATGTTGTCCAAGAGATATT-3′GenBan（KX375400.1）88710P25′-AATGCGCCTAAAGATAGTAGAAAAC-3′儀器設(shè)備PCR：4℃～100℃。低溫高速離心機(jī)，12000r/min以上。恒溫水浴鍋，室溫～100℃。0.1mg。水平電泳槽。恒溫水浴鍋，室溫～100℃。0.1mg。水平電泳槽。1V～300V；1mA～400mA。凝膠成像系統(tǒng)。2μL、10μL、20μL、100μL200μL。6樣品采集按照NY/T541規(guī)定采集牛抗凝全血，編號(hào)待處理。處理?？鼓?000r/min離心5min，取沉淀待檢。7試驗(yàn)步驟模板制備按血液基因組DNA提取試劑盒(4.1.1)操作說明書或等效方法提取模板DNA。PCR反應(yīng)體系2PCR反應(yīng)體系見表2。表2PCR檢測(cè)反應(yīng)體系試劑體積10×ExTaq緩沖液2.0μL2.5mmol/LdNTP（4.1.2）2.0μL10μmol/LP11.0μL10μmol/LP21.0μL5U/μLTaq酶（4.1.3）1.0μL25mg/LDNA模板4.0μL滅菌雙蒸水9.0μL總體積20μL質(zhì)量控制在試樣PCR反應(yīng)的同時(shí)，以無菌雙蒸水作為空白對(duì)照，并設(shè)置陰性對(duì)照和陽性對(duì)照，各對(duì)照PCR反應(yīng)體系中，除模板外其余組分及PCR反應(yīng)條件與7.2.1相同。反應(yīng)條件延伸7min，4℃保存。7.3電泳將所有樣品、陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照的PCR產(chǎn)物按編號(hào)加入到1%瓊脂糖凝膠板的各孔中，將凝膠的邊孔中加入DNAMarker分子量標(biāo)準(zhǔn)（4.1.4），將凝膠在150V恒定電壓下電泳30min后，凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。8結(jié)果判定試驗(yàn)成立條件空白對(duì)照、陰性對(duì)照無擴(kuò)增條帶，陽性對(duì)照出現(xiàn)887bp的特異性條帶，試驗(yàn)成立，否則應(yīng)重新檢測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照和擴(kuò)增序列見附錄C。試驗(yàn)結(jié)果判定887bp9廢棄物處理試驗(yàn)過程中產(chǎn)生的廢棄物，按GB19489規(guī)定處理。395545延伸7min，4℃保存。7.3電泳將所有樣品、陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照的PCR產(chǎn)物按編號(hào)加入到1%瓊脂糖凝膠板的各孔中，將凝膠的邊孔中加入DNAMarker分子量標(biāo)準(zhǔn)（4.1.4），將凝膠在150V恒定電壓下電泳30min后，凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。8結(jié)果判定試驗(yàn)成立條件空白對(duì)照、陰性對(duì)照無擴(kuò)增條帶，陽性對(duì)照出現(xiàn)887bp的特異性條帶，試驗(yàn)成立，否則應(yīng)重新檢測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照和擴(kuò)增序列見附錄C。試驗(yàn)結(jié)果判定887bp9廢棄物處理試驗(yàn)過程中產(chǎn)生的廢棄物，按GB19489規(guī)定處理。3DB22/T3366DB22/T3366—2022DB22/T3366DB22/T3366—2022A.2 加樣緩沖液A.2 加樣緩沖液加樣緩沖液的配制見表A.3。表A.3加樣緩沖液A.310mg/mL溴化乙錠10mg/mL溴化乙錠的的配制見表A.4。4附錄A（規(guī)范性附錄）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）試驗(yàn)常用試劑配制0×TAE緩沖液0.5mol/L（EDTA（pH8.0）A.1。表A105LH.乙二銨四乙酸二鈉18.6g滅菌雙蒸水80mL氫氧化鈉調(diào)pH至8.0滅菌雙蒸水定容至100mLTAE緩沖液（50×）A.2。表A.2TAE緩沖液（50×）配制三羥甲基氨基甲烷（Tris）242g冰乙酸57.1mL0.5mol/L乙二銨四乙酸（EDTA）（pH8.0）10mL注：加去離子水定容至100mL，室溫保存?zhèn)溆?，使用時(shí)稀釋50×為工作液。溴酚藍(lán)10mg甘油2.5mL0.5mol/LpH6.8的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液定容至10mL表A.410mg/mL溴化乙錠0.1g水（H2O）定容至10mL1%瓊脂糖凝膠（注意用微波爐加熱時(shí)不要沸出50℃左右，加入10mg/mL10μL，搖勻，倒入電泳板上，凝固后，4℃?zhèn)溆谩?%A.5。表A.51%瓊脂糖凝膠的制備瓊脂糖1g1×TAE緩沖液定容至100mL陽性對(duì)照以含有中華泰勒蟲887bp目的基因的質(zhì)粒DNA作為標(biāo)準(zhǔn)陽性對(duì)照。A.6陰性對(duì)照A.6陰性對(duì)照以未感染中華泰勒蟲牛血液提取的DNA作為標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照。5附錄B（規(guī)范性附錄）質(zhì)粒DNA制備質(zhì)粒DNA制備：DNA(4.1.1)DNA；MPSPPCR887bp目的基因片段；DNA（4.1.12）PCR將4μLPCR1μLPMD18-T5μLSolutionIPCR162h；10μL50μLDH5α30min，42s，2min200μLLB372hAmpLB，3712h；LBAmpLBDNA（4.1.13）DNA；DNAPCR887bpDNA-2066附錄C（規(guī)范性附錄標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照見圖C.1。M:DL2000DNAMarker；1:標(biāo)準(zhǔn)陽性對(duì)照；2:標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照。圖C.1牛中華泰勒蟲PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)陽性、陰性對(duì)照陽性對(duì)照序列見圖C.2。cactgctatgttgtccaagagatattttaacgcactttgcttaggctatttcctcatcttctcagcccatgcagctgaagaagccaagaaagacggtgataagaaggatgataagaaggaaggtgataagaaggacttgactcttgaggtcactgccacatccgccgagaatgttacagtcaactccaccaatgcccttgatgttgtcttcaccgccgctgaaggcttccgcttcaagacccttaaggttggtgacaaaacattgtataccgtcgacacttccaaattcactcctactgttgcccacagactgaagcatggtgatgaccttttcttcaagctcaatctccacaacgccaagccacttttgttcaaaaagaagagtgacaaggaatgggttcagttcaactacgccacctacttggatgacgtcctttggaaggagaagaaggagaccaaggacctcgacgcttccaaattcgctgaggccaccctcttcaagagagaccccttcggctctggctacgtctacgacttcgtcggtaacttcaaggtcaagaaggttaccttcgagaacaaggacgttggcaagcatgacaagtgcaaatacaccgctgttaaagtgtacgtcggtgctgacaacaacaagattgtgagacttgactacttctacaccggcgatgagagattcaaggaggtttacttcaaattggttgatggcaaatggaagaagttggagcaaaacgatgc