讓載體構(gòu)建更easy，分子克隆其實(shí)可以ze么快！每個(gè)做過分子實(shí)驗(yàn)的人可能都會有這樣的經(jīng)歷：在經(jīng)過N次的PCR、酶切、連接、轉(zhuǎn)化之后，陽性率依舊很低，到底是哪一步出了問題？今天就給大家詳解一下可以一步法快速構(gòu)建同源重組載體，并且陽性率很高的方式：無縫克隆。無縫克隆技術(shù)是一種新的、快速、簡潔的克隆方法，可以在質(zhì)粒的任何位點(diǎn)進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)DNA的片斷的插入，而不需要任何限制性內(nèi)切酶和連接酶。突破傳統(tǒng)的雙酶切再加上連接，只需要一步重組法，即可得到高效率克隆的重組載體，大大提高了工作效率。我們先來將傳統(tǒng)克隆與無縫克隆做下比較：十天半月實(shí)驗(yàn)沒迸展“傳統(tǒng)”克隆無縫”克隆目的片段PCR+線性化載體我們先來將傳統(tǒng)克隆與無縫克隆做下比較：十天半月實(shí)驗(yàn)沒迸展“傳統(tǒng)”克隆無縫”克隆目的片段PCR+線性化載體轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 陽性率低NG□匕1己34U必丁m田IQ陽性率近100%目的片段PCR,一+贏U雌化雌跋而收.I矗傳統(tǒng)克隆無縫克隆

PCR引物設(shè)計(jì)需引入載體上的酶PCR引物設(shè)計(jì)需引入載體上的酶切位點(diǎn)，PCR產(chǎn)物再經(jīng)過酶切、膠回收、連接后定向克隆到目的載體上；需要查找合適的酶切位點(diǎn)，購買各種內(nèi)切酶；陽性率低；多個(gè)片段，通常只能分多次拼接。只需要一次反應(yīng)即可完成定向克隆，省略酶切、酶連等過程；對酶切位點(diǎn)無要求，可以把目的片段插入到任意載體的任意位點(diǎn)；連接片段之間不會引入任何其他序列；可以同時(shí)克隆多個(gè)片段。無縫克隆相較于傳統(tǒng)克隆的方式，優(yōu)勢顯而易見，，主要體現(xiàn)以下幾點(diǎn)：1、可以不需要任何限制性內(nèi)切酶、連接酶，也不需要磷酸化、末端補(bǔ)平等操作；2、可同時(shí)連接多個(gè)DNA片段，最多可達(dá)10個(gè)；3、不附加任何多余序列，精確定向連接；4、體系反應(yīng)時(shí)間僅需20min，快速反應(yīng)。那無縫克隆到底應(yīng)該怎么做呢？下面我們就來詳細(xì)了解下無縫克隆其原理：在基因克隆的引物設(shè)計(jì)及目的DNA片段的擴(kuò)增階段，與常規(guī)PCR法是相同的。唯一的差異在于載體末端和引物末端應(yīng)具有15-20個(gè)同源堿基，由此得到的PCR產(chǎn)物兩端便分別帶上了15-20個(gè)與載體序列同源性的堿基。

在用無縫克隆方式進(jìn)行分子克隆時(shí)，主要操作步驟分為以下3點(diǎn)：1、線性化目的載體（圖1左上）：用酶切或是PCR方式1）質(zhì)粒酶切法在目標(biāo)載體質(zhì)粒上選取合適的位點(diǎn)進(jìn)行單酶切或雙酶切，對酶切后的載體進(jìn)行割膠純化。2）質(zhì)粒PCR法如果沒有合適的酶切位點(diǎn)，你也可以通過PCR方法實(shí)現(xiàn)載體的線性化。

圖2.PCR圖2.PCR法線性化載體示意圖。在插入位點(diǎn)兩側(cè)設(shè)計(jì)一對方向相反的引物對載體進(jìn)行擴(kuò)增，通過跑膠回收獲取線性化載體片段2、PCR獲取目的片段。設(shè)計(jì)的引物5'端需要和線性化載體末端有15?25bp的重疊（圖中藍(lán)色和黃色片段）;C?'IGGCAGTCn?rCSAACITAi圖3:目的片段同源的引物設(shè)計(jì)C?'IGGCAGTCn?rCSAACITAi圖3:目的片段同源的引物設(shè)計(jì)針對雙酶切法線性化載體設(shè)計(jì)插入片段的PCR引物，其重疊區(qū)域?yàn)?5?25bp+酶切位點(diǎn)，這樣重組成功的質(zhì)粒上會完好保留此兩個(gè)酶切位點(diǎn)。如果是PCR法線性化載體，擴(kuò)增插入片段的PCR引物5’端直接設(shè)計(jì)成與線性化載體末端15?25bp重疊即可。3、按照一定比例把二者混合在HB-infusion?（無縫克隆試劑盒）的2x預(yù)混液內(nèi)，50℃反應(yīng)20min后直接轉(zhuǎn)化E.coli即可。反應(yīng)體系如下：2-3片段4-6片段陽性對照PCR產(chǎn)物+線性化載體質(zhì)粒Xpl(G.02-0.5pmoth)X|ll(0.2-1ptuoLs)10MlHB-lufUsionMasterMil(2k)10|d10W超純h3oUpto20國UpS20pl通過以上三步，就可以完成質(zhì)粒重組。只要再進(jìn)行后續(xù)的轉(zhuǎn)化感受態(tài)等操作，就可以完成載體構(gòu)建。當(dāng)然，這么簡單高效的分子克隆方式，怎么能少了HB-infusionT無縫克隆試劑盒呢！無論你是要做簡單的克隆，還是多片段克隆或者突變體克隆，包括載體改造和crispr載體構(gòu)建等都可以用到無縫克隆試劑盒。實(shí)例分享一：小片段（1kb）和大片段（4kb）基因克隆比較

r薩了/I1r薩了/I1旗無口NA酶歷臬國產(chǎn)