本文格式為Word版，下載可任意編輯——課題2,月季花藥培養(yǎng)

題課題2月季的花藥培養(yǎng)

課題背景1964年，印度科學(xué)家在培養(yǎng)毛葉曼陀羅的花藥時，首次獲得了由花藥中的花粉粒發(fā)育而來的單倍體植株。這個測驗說明生殖細(xì)胞和體細(xì)胞一樣，在離體條件下也具有發(fā)育成完整植株的潛能。自20世紀(jì)60年頭以來，花藥培養(yǎng)的研究進(jìn)展急速。據(jù)記載，世界上已有250多種高等植物的花藥培養(yǎng)獲得告成，其中小麥、玉米、大豆、甘蔗和橡膠等近50種植物的花粉再生植株已由我國科技人員首先培育告成。

植物的花藥培養(yǎng)在育種上有特殊的意義。育種工可以采用花藥培養(yǎng)的方法，使花粉粒發(fā)育為單倍體植株，再經(jīng)過人工誘導(dǎo)使染色體數(shù)目加倍，重新恢復(fù)到正常植株的染色體數(shù)目。這樣的植株不僅能夠正常生殖，而且每對染色體上的成對的基因都是純合的，自交產(chǎn)生的后代不會產(chǎn)生性狀分開。單倍體育種不僅縮短了育種周期，也為新品種的培育開發(fā)了新途徑。在本課題中，我們將嘗試月季的花藥培養(yǎng)。

根基學(xué)識（一）被子植物的花粉發(fā)育被子植物的雄蕊通常包含花絲、花藥兩片面?；ㄋ帪槟覡畈季郑瑑?nèi)部含有大量花粉?；ǚ凼怯苫ǚ勰讣?xì)胞經(jīng)過減數(shù)分裂而形成的，因此，花粉是單倍體的生殖細(xì)胞。被子植物花粉的發(fā)育要體驗小孢子四分體時期、單核期和雙核期等階段（圖3-6）。在小孢子四分體時期，4個單倍體細(xì)胞連在一起，進(jìn)入單核期時，四分體的4個單倍體細(xì)胞彼此分開，形成4個具有單細(xì)胞核的花粉粒。這時的細(xì)胞含濃重的原生質(zhì)，核位于細(xì)胞的中央（單核居中期）。隨著細(xì)胞不斷長大，細(xì)胞核由中央移向細(xì)胞一側(cè)（單核靠邊期），并分裂成1個生殖細(xì)胞核和1個花粉管細(xì)胞核，進(jìn)而形成兩個細(xì)胞，一個是生殖細(xì)胞，一個是養(yǎng)分細(xì)胞。生殖細(xì)胞將再分裂一次，形成兩個精子。

（二）產(chǎn)生花粉植株的兩種途徑

通過花藥培養(yǎng)產(chǎn)生花粉植株（即單倍體植株）一般有兩種途徑（圖3-7），一種是花粉通過胚狀體階段發(fā)育為植株，另一種是花粉在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上先形成愈傷組織，再將其誘導(dǎo)分化成植株。這兩種途徑之間并沒有十足的界限，主要取決于培養(yǎng)基中激素的種類及其濃度配比。

人們一向以為，植物細(xì)胞的離體培養(yǎng)只能通過分別誘導(dǎo)芽和根等器官再發(fā)育成植株。20世紀(jì)50年頭末，科學(xué)家在胡蘿卜根組織的單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液中察覺，某些體細(xì)胞在形態(tài)上轉(zhuǎn)變?yōu)榕c合子發(fā)育成的胚分外好像的布局，它的發(fā)育過程也與合子胚類似，胚芽、胚根、胚軸等布局完整，就像一顆種子?？茖W(xué)家將這種布局稱做體細(xì)胞胚（somaticembryo）或胚狀體（embryoid）。除了植物的體細(xì)胞外，由單倍體性細(xì)胞產(chǎn)生的花粉胚，也可發(fā)育成為單倍體植株。

（三）影響花藥培養(yǎng)的因素誘導(dǎo)花粉植株能否告成及誘導(dǎo)告成率的上下，受多種因素影響，其中材料的選擇與培養(yǎng)基的組成是主要的影響因素。

不同植物的誘導(dǎo)告成率很不一致。就同一種植物來說，親本植株的生理狀況對誘導(dǎo)告成率也有直接影響?；ㄆ谠缙跁r的花藥比后期的更輕易產(chǎn)生花粉植株。一般月季的花藥培養(yǎng)時間選在五月初到五月中旬，即月季的初花期。選擇適合的花粉發(fā)育時期也是提高誘導(dǎo)告成率的重要因素。這是由于并不是任何時期的花粉都可以經(jīng)過培養(yǎng)產(chǎn)生愈傷組織或胚狀體，在花粉發(fā)育的過程中，只有某一個時期對離體刺激敏感。一般來說，在單核期，細(xì)胞核由中央移向細(xì)胞一側(cè)的時期，花藥培養(yǎng)告成率最高。選擇單核期以前的花藥接種，質(zhì)地幼嫩，極易破碎；選擇單核期以后的花藥接種，花瓣已有些松動，又給材料的消毒帶來困難。為了挑揀到單核期的花藥，通常選擇完全未開放的花蕾（圖3-8）。盛開的或略微開放的花（圖3-9），都不宜選作測驗材料。此外，親本植株的生長條件、材料的低溫預(yù)處理以及接種密度等對誘導(dǎo)告成率都有確定影響。

花期一般指在一個生長季內(nèi)植株開花的時間段。譬如某些種類的月季，從5月初一向到11月都連續(xù)開花。那么5月初就叫做該種月季的初花期或花期早期。花期早期的花蕾養(yǎng)分狀態(tài)及生理狀態(tài)會對比好，能提高花粉誘導(dǎo)告成率。

為什么花瓣松動會給材料的消毒帶來困難？

測驗操作（一）

材料的選取選擇花藥時，一般要通過鏡檢來確定其中的花粉是否處于適合的發(fā)育期。確定花粉發(fā)育時期的最常用的方法有醋酸洋紅法。但是，某些植物的花粉細(xì)胞核不易著色，需采用焙花青-鉻礬法，這種方法能將花粉細(xì)胞核染成藍(lán)黑色。

醋酸洋紅法

將花藥放在載玻片上，加一滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的醋酸洋紅，用鑷柄將花藥搗碎，蓋上蓋玻片后在顯微鏡下檢查。醋酸洋紅的配制方法是：將體積分?jǐn)?shù)為45%的醋酸100mL煮沸，緩緩參與1g洋紅，再加熱回流（回流裝置參見專題6課題2）8h，冷卻至50℃，過濾即可。

焙花青-鉻礬法

花藥應(yīng)先在卡諾氏固定液中固定20min，然后取出放在載玻片上，加焙花青-鉻礬溶液染色，蓋上蓋玻片后在顯微鏡下檢查?？ㄖZ氏固定液的配制方法是：將無水酒精與冰醋酸按體積比為3:1的比例混勻。焙花青-鉻礬溶液的配制方法是：將5g鉻鉀礬[K2SO4Cr2（SO4）

324H2O]參與90mL蒸餾水中，溶解后參與0.1g焙花青，混勻并加熱至沸騰，煮沸5min后冷卻至室溫，過濾，加蒸餾水定容至100mL。

（二）

材料的消毒通常先將花蕾用體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精浸泡大約30s，立刻取出，在無菌水中清洗。取出后再用無菌吸水紙吸干花蕾外觀的水分，放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的氯化汞溶液中2～4min（也可用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的次氯酸鈣溶液或飽和漂白粉溶液），取出后再用無菌水沖洗3～5次。

（三）

接種和培養(yǎng)消毒后的花蕾，要在無菌條件下除去萼片和花瓣，并立刻將花藥接種到培養(yǎng)基上。在剝離花藥時，要盡量不損傷花藥（否那么接種后輕易從受傷部位產(chǎn)生愈傷組織），同時還要徹底去除花絲，由于與花絲相連的花藥不利于愈傷組織或胚狀體的形成。

通常每瓶接種花藥7～10個，培養(yǎng)溫度操縱在25℃左右，不需要光照。幼小植株形成后才需要光照。

一般經(jīng)過20～30d培養(yǎng)后，會察覺花藥開裂，長出愈傷組織或形成胚狀體。將愈傷組織實時轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，以便進(jìn)一步分化出再生植株。假設(shè)花藥開裂釋放出胚狀體，那么一個花藥內(nèi)就會產(chǎn)生大量幼小植株，務(wù)必在花藥開裂后盡快將幼小植株分開，分別移植到新的培養(yǎng)基上，否那么這些植株將很難分開。

在花藥培養(yǎng)中，更加是通過愈傷組織形成的花粉植株，染色體組的數(shù)目往往會發(fā)生變化。因此還需要對培養(yǎng)出來的植株作進(jìn)一步的鑒定和篩選。

月季花藥培養(yǎng)基配方在1000mLMS培養(yǎng)基配方中添加2，4-D

0.4mgKT

0.2mgIAA

4mg調(diào)理pH至5.8。

誘導(dǎo)叢芽或胚狀體的培養(yǎng)基配方MS培養(yǎng)基中添加GA、IBA和BA，質(zhì)量濃度分別為0.1mg/L、0.5mg/L和1mg/L。

誘導(dǎo)生根的培養(yǎng)基配方MS培養(yǎng)基各成分用量減半，添加IAA，質(zhì)量濃度為1.5mg/L。

結(jié)果分析與評價1.你能夠通過鏡檢找四處于適合的發(fā)育期的花粉嗎？2.你的花藥培養(yǎng)展現(xiàn)了被污染的現(xiàn)象嗎？假設(shè)有，請分析產(chǎn)生污染的理由。

3.你接種的花藥是否長出了花粉愈傷組織或胚狀體？

練習(xí)1.紫色、不甜的玉米（基因型為AASuSu）和白色、甜玉米（基因型為aasusu）雜交（Su和