第二十二章免疫學(xué)檢測技術(shù)的基本原理1第二十二章免疫學(xué)檢測技術(shù)的基本原理1主要內(nèi)容抗原和抗體的體外實驗免疫細(xì)胞功能的測定2主要內(nèi)容抗原和抗體的體外實驗2

免疫學(xué)檢測技術(shù)：運用免疫學(xué)原理設(shè)計的檢測方法可用于：診斷免疫相關(guān)性疾病探討發(fā)病機制監(jiān)測病情和治療效果3免疫學(xué)檢測技術(shù)：3第一節(jié)抗原或抗體的檢測對感染性疾病的診斷：感染早期：查病原體（抗原）感染晚期：檢測特異性抗體抗原抗體的檢測方法

=血清學(xué)方法（血清學(xué)反應(yīng)，serologicalreaction）

用已知Ag檢測未知Ab(?)

用已知Ab檢測未知Ag(?)4第一節(jié)抗原或抗體的檢測對感染性疾病的診斷：抗原抗體的檢測方一、抗原抗體反應(yīng)的原理：（一）特異性：Ag（表位）與Ab(CDR)的結(jié)合可逆性：非共價鍵結(jié)合（二）可見性：Ab與Ag的比例合適

形成肉眼可見聚合物。階段性：特異性結(jié)合階段：幾秒~幾分鐘可見反應(yīng)階段：幾分鐘~幾小時~幾十小時5一、抗原抗體反應(yīng)的原理：（一）特異性：Ag（表位）與Ab(C影響抗原抗體反應(yīng)的主要因素：Ag與Ab的濃度、比例電解質(zhì):0.85%NaCl溫度:370C酸堿度:pH=6-8Ag濃度Ag–Ab復(fù)合物前帶后帶等價帶6影響抗原抗體反應(yīng)的主要因素：Ag與Ab的濃度、比例電解質(zhì):抗原與抗體的種類：抗原的類型：顆粒性抗原：細(xì)胞，細(xì)菌，人工微球/珠可溶性抗原：細(xì)胞成分，蛋白分子，小分子化合物7抗原與抗體的種類：抗原的類型：7抗體的類型：多克隆抗體(抗血清):識別多個表位，特異性差單克隆抗體：識別單個表位，特異性好抗-抗體（二抗）：抗異種Ig的抗體8抗體的類型：8二、抗原或抗體的檢測方法（一）凝集反應(yīng)：（agglutination）

顆粒性抗原（或可溶性抗原吸附在與免疫無關(guān)的載體上）與相應(yīng)抗體在適當(dāng)條件下形成肉眼可見的凝集小塊。

9二、抗原或抗體的檢測方法（一）凝集反應(yīng)：（agglutina1、直接凝集反應(yīng)：

天然顆粒性抗原（細(xì)菌或細(xì)胞）與相應(yīng)抗體直接結(jié)合所出現(xiàn)的凝集現(xiàn)象：（1）玻片法—定性試驗：已知Ab

未知Ag(?)

ABO血型鑒定，細(xì)菌種屬抗原型別的鑒定+101、直接凝集反應(yīng)：+10（2）試管法—半定量試驗：

診斷傷寒副傷寒的“肥達(dá)氏反應(yīng)”病人血清倍比稀釋傷寒細(xì)菌懸液1:21:41:81:161:321:64對照11病人血清倍比稀釋傷寒細(xì)菌懸液1:21:41:81:161:32、間接凝集反應(yīng)：++—載體：紅血球：間接血凝試驗122、間接凝集反應(yīng)：++—載體：紅血球：間接血凝試驗（二）沉淀反應(yīng)

(precipitation)

：

可溶性性抗原與相應(yīng)抗體直接結(jié)合，在適當(dāng)條件下形成肉眼可見的沉淀現(xiàn)象（沉淀線）。1、單向免疫擴散(radicalimmunodiffusion)：可定量檢測Ag13（二）沉淀反應(yīng)(precipitation)：1、單向免含抗人IgG瓊脂制成平板待測血樣(IgG濃度?)標(biāo)準(zhǔn)人IgG不同濃度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線待測樣品結(jié)果14含抗人IgG瓊脂待測血樣(IgG濃度?)標(biāo)準(zhǔn)人IgG不同濃度2、雙向免疫擴散(doubleimmunodiffusion)：----定性檢測Ag或Ab；Ab效價滴定AgAb擴散AgAb擴散1:21:41:81:161:241:64152、雙向免疫擴散(doubleimmunodiffusio1616３、免疫電泳（immunoelectrophoresis)+標(biāo)本先電泳**************************兩側(cè)挖槽加Ab孵育后出現(xiàn)肉眼可見沉淀-17３、免疫電泳（immunoelectrophoresis18184、火箭電泳：單擴試驗+電泳

可定量分析194、火箭電泳：單擴試驗+電泳5、免疫比濁：Ag＋AbAg-Ab（免疫復(fù)合物）比濁儀測量濁度，計算抗原含量目前替代單擴測量血清Ig205、免疫比濁：Ag＋AbAg-Ab（（四）免疫標(biāo)記技術(shù)

－用標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)：利用熒光素、酶、放射性同位素以及膠體金標(biāo)記抗體，以檢測相應(yīng)抗原的技術(shù)1、免疫熒光技術(shù)

（immunofluorescencetechniques）利用熒光素標(biāo)記抗體或抗抗體以檢測細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)抗原的技術(shù)。21（四）免疫標(biāo)記技術(shù)

－用標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行抗原抗體1、免疫熒光技術(shù)

（immunofluorescencetechniques）直接法

間接法

221、免疫熒光技術(shù)

（immunofluoresce2323間接免疫熒光檢測自身抗核抗體24間接免疫熒光檢測自身抗核抗體24用酶標(biāo)記Ab(或Ag)與標(biāo)本中的Ag(或Ab)發(fā)生特異性結(jié)合加入酶的底物，在酶作用下產(chǎn)生有色物質(zhì)根據(jù)顏色可作出判斷或測量光密度值免疫酶標(biāo)技術(shù)：酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）2、免疫酶標(biāo)技術(shù)：25用酶標(biāo)記Ab(或Ag)與標(biāo)本中的Ag(或Ab)發(fā)生特異性結(jié)合（1）雙抗體夾心法：+++26（1）雙抗體夾心法：+++26（2）間接法+++27（2）間接法+++2728283、放射免疫測定

（radioimmunoassay，RIA）：利用放射性同位素標(biāo)記技術(shù)檢測抗原的技術(shù)靈敏度高，用于檢測激素等血清中微量物質(zhì)293、放射免疫測定

（radioimmunoassay，RI4.免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)

(immunologiccolloidalgoldsignature，ICS)

膠體金顆粒表面帶有較多電荷，用膠體金顆粒標(biāo)記抗體，檢測組織或細(xì)胞標(biāo)本中的抗原。304.免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)

(immunologiccollo常用方法：膠體金斑點滲濾試驗?zāi)z體金斑點免疫層析試驗BDCTA31常用方法：膠體金斑點滲濾試驗BDCTA31第二節(jié)免疫細(xì)胞測定一、淋巴細(xì)胞的分離與類型鑒定外周血單個核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。

紅細(xì)胞和多核白細(xì)胞密度：為1.092左右，淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞密度：1.075～1.090，血小板密度：1.030～1.035。聚蔗糖－泛影葡胺(Ficoll):1.077±0.00132第二節(jié)免疫細(xì)胞測定一、淋巴細(xì)胞的分離與類型鑒定32一、免疫細(xì)胞的分離：（一）外周血單個核細(xì)胞（PBMC）的分離：方法：密度梯度離心法分離液：聚蔗糖泛影葡胺（比重：1.077±0.001）稀釋全血分離液RBC粒細(xì)胞PBMC稀釋血漿33一、免疫細(xì)胞的分離：稀釋全血分離液RBC粒細(xì)胞PBMC稀釋（二）T、B細(xì)胞的純化：

貼壁法——去除單核細(xì)胞花環(huán)沉降法、尼龍毛法——分離T、B細(xì)胞（三）免疫磁珠分離法：（四）FACS分離法：34（二）T、B細(xì)胞的純化：34二、T細(xì)胞數(shù)量檢測：1、E花環(huán)試驗：原理：T細(xì)胞均有CD2分子，而B細(xì)胞無;將SRBC與人外周血淋巴細(xì)胞混合;SRBC可結(jié)合于T細(xì)胞周圍形成花環(huán)細(xì)胞。35二、T細(xì)胞數(shù)量檢測：352、免疫熒光標(biāo)記技術(shù)：用熒光素標(biāo)記CD3、CD4或CD8單抗與淋巴細(xì)胞混合經(jīng)熒光顯微鏡觀察或用流式細(xì)胞儀測定362、免疫熒光標(biāo)記技術(shù)：3637373838三、NK細(xì)胞殺傷功能檢測：

-----NK細(xì)胞具有非特異殺傷腫瘤活性，在體外與腫瘤細(xì)胞混合，可被激活而殺傷腫瘤細(xì)胞取外周血淋巴細(xì)胞（含NK細(xì)胞）與K562（白血病細(xì)胞株）混合，孵育4h通過形態(tài)學(xué)或細(xì)胞計數(shù)方法檢測K562腫瘤細(xì)胞被殺傷的數(shù)量計算NK細(xì)胞的殺傷活性39三、NK細(xì)胞殺傷功能檢測：-----NK細(xì)胞具有非四、白細(xì)胞功能測定（一）、T細(xì)胞功能測定１、Ｔ細(xì)胞增殖試驗T細(xì)胞對特異和非特異性抗原的識別過程不同，但被激活后，誘發(fā)的分裂和增殖過程卻是相同。用T細(xì)胞敏感刺激物體外刺激T細(xì)胞，T細(xì)胞發(fā)生增殖、轉(zhuǎn)化，根據(jù)增殖轉(zhuǎn)化能力評價T細(xì)胞功能。40四、白細(xì)胞功能測定（一）、T細(xì)胞功能測定40形態(tài)學(xué)特征:

體積增大4---5倍;核染色體疏松;核仁明顯;胞漿出現(xiàn)空泡。1、T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗：41形態(tài)學(xué)特征:1、T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗：41（１）3H-TdR細(xì)胞周期外周血中T細(xì)胞通常處于細(xì)胞周期的G0期，受特異性抗原或促有絲分裂原激活后，從G0期進(jìn)入G1期，并合成蛋白質(zhì)、RNA和DNA前體物質(zhì)等，為DNA復(fù)制準(zhǔn)備物質(zhì)基礎(chǔ)，然后進(jìn)入S期，細(xì)胞合成DNA量倍增，此時若在培養(yǎng)液中加3H標(biāo)記的DNA前體(3H-胸腺嘧啶核苷，3H-TdR)，后者即摻入新合成的DNA中，根據(jù)摻入的多少推測細(xì)胞增殖程度。42（１）3H-TdR42

將單個核細(xì)胞懸液加入含培養(yǎng)液的試管中，實驗管加適量PHA后，空白對照不加PHA，置5％CO2溫箱37℃培養(yǎng)56h，加適量3H-TdR，繼續(xù)培養(yǎng)16h，收集細(xì)胞，用液體閃爍器測量，記錄每分鐘脈沖數(shù)(cpm)，刺激指數(shù)(SI)表示轉(zhuǎn)化能力。SI＝PHA刺激管cpm均值/對照管cpm均值SI＞243將單個核細(xì)胞懸液加入含培養(yǎng)液的試管中，實43

（2）MTT法單個核細(xì)胞與PHA混合培養(yǎng)70h后，加入四甲基偶氮唑鹽（MTT）后再培養(yǎng)4~6h，MTT在活細(xì)胞線粒體的琥珀酸脫氫酶作用下，被還原成藍(lán)黑色的MTT-甲，形成MTT-甲的量與細(xì)胞增殖程度正相關(guān)，測OD值：SI=試驗孔OD值/對照孔OD值44（2）MTT法44２、細(xì)胞毒試驗CTL、NK細(xì)胞對靶細(xì)胞有直接殺傷作用，依據(jù)待檢細(xì)胞的性質(zhì)，選用相應(yīng)靶細(xì)胞，根據(jù)靶細(xì)胞破壞程度，鑒定相應(yīng)細(xì)胞的功能。45２、細(xì)胞毒試驗453.細(xì)胞因子的檢測1)、免疫學(xué)檢測：ELISA

細(xì)胞增殖法：IL-1、IL-2等靶細(xì)胞殺傷法：TNF2)、生物活性檢測法3)、分子生物學(xué)方法:RT-PCR檢測mRNA463.細(xì)胞因子的檢測1)、免疫學(xué)檢測：ELISA46

細(xì)胞因子檢測可了解免疫調(diào)節(jié)，了解淋巴細(xì)胞亞群。免疫學(xué)檢測法（1）雙抗體夾心法（2）ELISPOT（3）FCM法47細(xì)胞因子檢測可了解免疫調(diào)節(jié)，了解淋巴細(xì)胞亞群。47

（2）生物活性測定法根據(jù)細(xì)胞因子的生物學(xué)活性，選用相應(yīng)實驗系統(tǒng)：細(xì)胞增殖法直接殺傷法保護(hù)細(xì)胞免受病毒致病變法48（2）生物活性測定法48（3）分子生物學(xué)方法：檢測基因表達(dá)

RT－PCR法

根據(jù)細(xì)胞因子的核酸序列，設(shè)計引物，利用逆轉(zhuǎn)錄PCR測定特定細(xì)胞因子的mRNA的表達(dá)。49（3）分子生物學(xué)方法：檢測基因表達(dá)494、皮膚試驗（體內(nèi)實驗）

結(jié)核菌素皮膚試驗：即OT/PPD皮試。---反映體內(nèi)細(xì)胞免疫功能水平。

以遲發(fā)型超敏反應(yīng)檢測細(xì)胞免疫功能。504、皮膚試驗（體內(nèi)實驗）50（二）B細(xì)胞功能測定（１）B細(xì)胞增殖試驗LPS、SPA、抗IgM抗體B細(xì)胞受絲裂原刺激后分裂增殖，培養(yǎng)一定時間后計數(shù)抗體形成細(xì)胞的數(shù)目。51（二）B細(xì)胞功能測定（１）B細(xì)胞增殖試驗51（2）抗體形成細(xì)胞測定溶血空斑形成試驗PBMC或組織來源的淋巴細(xì)胞、SPA-致敏的羊紅細(xì)胞（SPA-SRBC）、抗人Ig抗體及補體4種成分混合在溶化的0.5%瓊脂糖內(nèi)，注入密封小室內(nèi)?？谷薎g的Fc段與SPA-SRBC結(jié)合，抗體形成細(xì)胞分泌的Ig與抗人Ig結(jié)合后活化補體，導(dǎo)致SRBC溶血，形成一個肉眼可見的圓形透明溶血區(qū)而成為溶血空斑（plaque）。每一個空斑表示一個抗體形成細(xì)胞。52（2）抗體形成細(xì)胞測定52（三）吞噬細(xì)胞功能測定１、趨化功能測定（１）、Boyden小室法由上下兩室組成，中間隔以8μm的微孔濾膜。檢測細(xì)胞置于上室，趨化因子置于下室，如被趨化因子吸引，細(xì)胞通過濾膜并爬行于濾膜下側(cè)，染色、計數(shù)可知趨化情況。53（三）吞噬細(xì)胞功能測定１、趨化功能測定53（２）、瓊脂凝膠法（３）、過氧化物酶法中性粒細(xì)胞內(nèi)含有過氧化物酶，趨化后溶解細(xì)胞，加入過氧化物酶底物二甲氧苯胺，，405nm比色，以反映趨化活性。54（２）、瓊脂凝膠法542、吞噬功能測定（１）、硝基藍(lán)四氮唑試驗在白細(xì)胞中加入硝基藍(lán)四氮唑試驗溶液，中性粒細(xì)胞在殺菌過程中產(chǎn)生ROI，其中超氧陰離子能使被吞噬進(jìn)細(xì)胞的NBT還原成不溶解的暗蘭色甲，沉積于胞漿中，稱NBT陽性細(xì)胞，反映吞噬功能。552、吞噬功能測定55（２）熒光標(biāo)記物試驗將熒光素標(biāo)記的生物顆粒（如白色念珠菌等）與白細(xì)胞混合后，溫育一定時間后加入臺盼藍(lán)并洗滌，以除去未被吞噬的熒光顆粒，離心收集細(xì)胞，重懸后用熒光分光光度計定量分析。56（２）熒光標(biāo)記物試驗56第三節(jié)免疫學(xué)檢測方法的應(yīng)用一、免疫學(xué)檢測方法的評估與選擇金標(biāo)準(zhǔn)：公認(rèn)可靠的診斷方法。特異性：用某方法檢查非患者時出現(xiàn)陰性的可能性

特異性＝真陰性/（真陰性＋假陽性）X100％敏感性：用該方法檢查患者時出現(xiàn)陽性的可能性。

敏感性＝真陽性/（真陽性＋假陰性）X100％57第三節(jié)免疫學(xué)檢測方法的應(yīng)用一、免疫學(xué)檢測方法的評估與選擇１、感染性疾病２、免疫缺陷病３、自身免疫?。?、超敏反應(yīng)性疾?。?、腫瘤二、疾病的診斷58１、感染性疾病二、疾病的診斷58１、感染性疾?。?/p>

動態(tài)觀察病原體與抗體的消長２、HIV感染與免疫缺陷?。?/p>

動態(tài)觀察CD4+T細(xì)胞數(shù)量３、腫瘤患者：動態(tài)監(jiān)測察腫瘤相關(guān)抗原的水平4、器官移植患者：動態(tài)觀察T細(xì)胞活化標(biāo)志的表達(dá)三、免疫學(xué)監(jiān)測59１、感染性疾病：三、免疫學(xué)監(jiān)測59第二十二章免疫學(xué)檢測技術(shù)的基本原理60第二十二章免疫學(xué)檢測技術(shù)的基本原理1主要內(nèi)容抗原和抗體的體外實驗免疫細(xì)胞功能的測定61主要內(nèi)容抗原和抗體的體外實驗2

免疫學(xué)檢測技術(shù)：運用免疫學(xué)原理設(shè)計的檢測方法可用于：診斷免疫相關(guān)性疾病探討發(fā)病機制監(jiān)測病情和治療效果62免疫學(xué)檢測技術(shù)：3第一節(jié)抗原或抗體的檢測對感染性疾病的診斷：感染早期：查病原體（抗原）感染晚期：檢測特異性抗體抗原抗體的檢測方法

=血清學(xué)方法（血清學(xué)反應(yīng)，serologicalreaction）

用已知Ag檢測未知Ab(?)

用已知Ab檢測未知Ag(?)63第一節(jié)抗原或抗體的檢測對感染性疾病的診斷：抗原抗體的檢測方一、抗原抗體反應(yīng)的原理：（一）特異性：Ag（表位）與Ab(CDR)的結(jié)合可逆性：非共價鍵結(jié)合（二）可見性：Ab與Ag的比例合適

形成肉眼可見聚合物。階段性：特異性結(jié)合階段：幾秒~幾分鐘可見反應(yīng)階段：幾分鐘~幾小時~幾十小時64一、抗原抗體反應(yīng)的原理：（一）特異性：Ag（表位）與Ab(C影響抗原抗體反應(yīng)的主要因素：Ag與Ab的濃度、比例電解質(zhì):0.85%NaCl溫度:370C酸堿度:pH=6-8Ag濃度Ag–Ab復(fù)合物前帶后帶等價帶65影響抗原抗體反應(yīng)的主要因素：Ag與Ab的濃度、比例電解質(zhì):抗原與抗體的種類：抗原的類型：顆粒性抗原：細(xì)胞，細(xì)菌，人工微球/珠可溶性抗原：細(xì)胞成分，蛋白分子，小分子化合物66抗原與抗體的種類：抗原的類型：7抗體的類型：多克隆抗體(抗血清):識別多個表位，特異性差單克隆抗體：識別單個表位，特異性好抗-抗體（二抗）：抗異種Ig的抗體67抗體的類型：8二、抗原或抗體的檢測方法（一）凝集反應(yīng)：（agglutination）

顆粒性抗原（或可溶性抗原吸附在與免疫無關(guān)的載體上）與相應(yīng)抗體在適當(dāng)條件下形成肉眼可見的凝集小塊。

68二、抗原或抗體的檢測方法（一）凝集反應(yīng)：（agglutina1、直接凝集反應(yīng)：

天然顆粒性抗原（細(xì)菌或細(xì)胞）與相應(yīng)抗體直接結(jié)合所出現(xiàn)的凝集現(xiàn)象：（1）玻片法—定性試驗：已知Ab

未知Ag(?)

ABO血型鑒定，細(xì)菌種屬抗原型別的鑒定+691、直接凝集反應(yīng)：+10（2）試管法—半定量試驗：

診斷傷寒副傷寒的“肥達(dá)氏反應(yīng)”病人血清倍比稀釋傷寒細(xì)菌懸液1:21:41:81:161:321:64對照70病人血清倍比稀釋傷寒細(xì)菌懸液1:21:41:81:161:32、間接凝集反應(yīng)：++—載體：紅血球：間接血凝試驗712、間接凝集反應(yīng)：++—載體：紅血球：間接血凝試驗（二）沉淀反應(yīng)

(precipitation)

：

可溶性性抗原與相應(yīng)抗體直接結(jié)合，在適當(dāng)條件下形成肉眼可見的沉淀現(xiàn)象（沉淀線）。1、單向免疫擴散(radicalimmunodiffusion)：可定量檢測Ag72（二）沉淀反應(yīng)(precipitation)：1、單向免含抗人IgG瓊脂制成平板待測血樣(IgG濃度?)標(biāo)準(zhǔn)人IgG不同濃度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線待測樣品結(jié)果73含抗人IgG瓊脂待測血樣(IgG濃度?)標(biāo)準(zhǔn)人IgG不同濃度2、雙向免疫擴散(doubleimmunodiffusion)：----定性檢測Ag或Ab；Ab效價滴定AgAb擴散AgAb擴散1:21:41:81:161:241:64742、雙向免疫擴散(doubleimmunodiffusio7516３、免疫電泳（immunoelectrophoresis)+標(biāo)本先電泳**************************兩側(cè)挖槽加Ab孵育后出現(xiàn)肉眼可見沉淀-76３、免疫電泳（immunoelectrophoresis77184、火箭電泳：單擴試驗+電泳

可定量分析784、火箭電泳：單擴試驗+電泳5、免疫比濁：Ag＋AbAg-Ab（免疫復(fù)合物）比濁儀測量濁度，計算抗原含量目前替代單擴測量血清Ig795、免疫比濁：Ag＋AbAg-Ab（（四）免疫標(biāo)記技術(shù)

－用標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)：利用熒光素、酶、放射性同位素以及膠體金標(biāo)記抗體，以檢測相應(yīng)抗原的技術(shù)1、免疫熒光技術(shù)

（immunofluorescencetechniques）利用熒光素標(biāo)記抗體或抗抗體以檢測細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)抗原的技術(shù)。80（四）免疫標(biāo)記技術(shù)

－用標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行抗原抗體1、免疫熒光技術(shù)

（immunofluorescencetechniques）直接法

間接法

811、免疫熒光技術(shù)

（immunofluoresce8223間接免疫熒光檢測自身抗核抗體83間接免疫熒光檢測自身抗核抗體24用酶標(biāo)記Ab(或Ag)與標(biāo)本中的Ag(或Ab)發(fā)生特異性結(jié)合加入酶的底物，在酶作用下產(chǎn)生有色物質(zhì)根據(jù)顏色可作出判斷或測量光密度值免疫酶標(biāo)技術(shù)：酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）2、免疫酶標(biāo)技術(shù)：84用酶標(biāo)記Ab(或Ag)與標(biāo)本中的Ag(或Ab)發(fā)生特異性結(jié)合（1）雙抗體夾心法：+++85（1）雙抗體夾心法：+++26（2）間接法+++86（2）間接法+++2787283、放射免疫測定

（radioimmunoassay，RIA）：利用放射性同位素標(biāo)記技術(shù)檢測抗原的技術(shù)靈敏度高，用于檢測激素等血清中微量物質(zhì)883、放射免疫測定

（radioimmunoassay，RI4.免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)

(immunologiccolloidalgoldsignature，ICS)

膠體金顆粒表面帶有較多電荷，用膠體金顆粒標(biāo)記抗體，檢測組織或細(xì)胞標(biāo)本中的抗原。894.免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)

(immunologiccollo常用方法：膠體金斑點滲濾試驗?zāi)z體金斑點免疫層析試驗BDCTA90常用方法：膠體金斑點滲濾試驗BDCTA31第二節(jié)免疫細(xì)胞測定一、淋巴細(xì)胞的分離與類型鑒定外周血單個核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。

紅細(xì)胞和多核白細(xì)胞密度：為1.092左右，淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞密度：1.075～1.090，血小板密度：1.030～1.035。聚蔗糖－泛影葡胺(Ficoll):1.077±0.00191第二節(jié)免疫細(xì)胞測定一、淋巴細(xì)胞的分離與類型鑒定32一、免疫細(xì)胞的分離：（一）外周血單個核細(xì)胞（PBMC）的分離：方法：密度梯度離心法分離液：聚蔗糖泛影葡胺（比重：1.077±0.001）稀釋全血分離液RBC粒細(xì)胞PBMC稀釋血漿92一、免疫細(xì)胞的分離：稀釋全血分離液RBC粒細(xì)胞PBMC稀釋（二）T、B細(xì)胞的純化：

貼壁法——去除單核細(xì)胞花環(huán)沉降法、尼龍毛法——分離T、B細(xì)胞（三）免疫磁珠分離法：（四）FACS分離法：93（二）T、B細(xì)胞的純化：34二、T細(xì)胞數(shù)量檢測：1、E花環(huán)試驗：原理：T細(xì)胞均有CD2分子，而B細(xì)胞無;將SRBC與人外周血淋巴細(xì)胞混合;SRBC可結(jié)合于T細(xì)胞周圍形成花環(huán)細(xì)胞。94二、T細(xì)胞數(shù)量檢測：352、免疫熒光標(biāo)記技術(shù)：用熒光素標(biāo)記CD3、CD4或CD8單抗與淋巴細(xì)胞混合經(jīng)熒光顯微鏡觀察或用流式細(xì)胞儀測定952、免疫熒光標(biāo)記技術(shù)：3696379738三、NK細(xì)胞殺傷功能檢測：

-----NK細(xì)胞具有非特異殺傷腫瘤活性，在體外與腫瘤細(xì)胞混合，可被激活而殺傷腫瘤細(xì)胞取外周血淋巴細(xì)胞（含NK細(xì)胞）與K562（白血病細(xì)胞株）混合，孵育4h通過形態(tài)學(xué)或細(xì)胞計數(shù)方法檢測K562腫瘤細(xì)胞被殺傷的數(shù)量計算NK細(xì)胞的殺傷活性98三、NK細(xì)胞殺傷功能檢測：-----NK細(xì)胞具有非四、白細(xì)胞功能測定（一）、T細(xì)胞功能測定１、Ｔ細(xì)胞增殖試驗T細(xì)胞對特異和非特異性抗原的識別過程不同，但被激活后，誘發(fā)的分裂和增殖過程卻是相同。用T細(xì)胞敏感刺激物體外刺激T細(xì)胞，T細(xì)胞發(fā)生增殖、轉(zhuǎn)化，根據(jù)增殖轉(zhuǎn)化能力評價T細(xì)胞功能。99四、白細(xì)胞功能測定（一）、T細(xì)胞功能測定40形態(tài)學(xué)特征:

體積增大4---5倍;核染色體疏松;核仁明顯;胞漿出現(xiàn)空泡。1、T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗：100形態(tài)學(xué)特征:1、T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗：41（１）3H-TdR細(xì)胞周期外周血中T細(xì)胞通常處于細(xì)胞周期的G0期，受特異性抗原或促有絲分裂原激活后，從G0期進(jìn)入G1期，并合成蛋白質(zhì)、RNA和DNA前體物質(zhì)等，為DNA復(fù)制準(zhǔn)備物質(zhì)基礎(chǔ)，然后進(jìn)入S期，細(xì)胞合成DNA量倍增，此時若在培養(yǎng)液中加3H標(biāo)記的DNA前體(3H-胸腺嘧啶核苷，3H-TdR)，后者即摻入新合成的DNA中，根據(jù)摻入的多少推測細(xì)胞增殖程度。101（１）3H-TdR42

將單個核細(xì)胞懸液加入含培養(yǎng)液的試管中，實驗管加適量PHA后，空白對照不加PHA，置5％CO2溫箱37℃培養(yǎng)56h，加適量3H-TdR，繼續(xù)培養(yǎng)16h，收集細(xì)胞，用液體閃爍器測量，記錄每分鐘脈沖數(shù)(cpm)，刺激指數(shù)(SI)表示轉(zhuǎn)化能力。SI＝PHA刺激管cpm均值/對照管cpm均值SI＞2102將單個核細(xì)胞懸液加入含培養(yǎng)液的試管中，實43

（2）MTT法單個核細(xì)胞與PHA混合培養(yǎng)70h后，加入四甲基偶氮唑鹽（MTT）后再培養(yǎng)4~6h，MTT在活細(xì)胞線粒體的琥珀酸脫氫酶作用下，被還原成藍(lán)黑色的MTT-甲，形成MTT-甲的量與細(xì)胞增殖程度正相關(guān)，測OD值：SI=試驗孔OD值/對照孔OD值103（2）MTT法44２、細(xì)胞毒試驗CTL、NK細(xì)胞對靶細(xì)胞有直接殺傷作用，依據(jù)待檢細(xì)胞的性質(zhì)，選用相應(yīng)靶細(xì)胞，根據(jù)靶細(xì)胞破壞程度，鑒定相應(yīng)細(xì)胞的功能。104２、細(xì)胞毒試驗453.細(xì)胞因子的檢測1)、免疫學(xué)檢測：ELISA

細(xì)胞增殖法：IL-1、IL-2等靶細(xì)胞殺傷法：TNF2)、生物活性檢測法3)、分子生物學(xué)方法:RT-PCR檢測mRNA1053.細(xì)胞因子的檢測1)、免疫學(xué)檢測：ELISA46

細(xì)胞因子檢測可了解免疫調(diào)節(jié)，了解淋巴細(xì)胞亞群。免疫學(xué)檢測法（1）雙抗體夾心法（2）ELISPOT（3）FCM法106細(xì)胞因子檢測可了解免疫調(diào)節(jié)，了解淋巴細(xì)胞亞群。47

（2）生物活性測定法根據(jù)細(xì)胞因子的生物學(xué)活性，選用相應(yīng)實驗系統(tǒng)：細(xì)胞增殖法直接殺傷法保護(hù)細(xì)胞免受病毒致病變法107（2）生物活性測定法48（3）分子生物學(xué)方法：檢測基因表達(dá)

RT－PCR法

根據(jù)細(xì)胞因子的核酸序列，設(shè)計引物，利用逆轉(zhuǎn)錄PCR測定特定細(xì)胞因子的mRNA的表達(dá)。108（3）分子生物學(xué)方法：檢測基因表達(dá)494、皮膚試驗（體內(nèi)實驗）

結(jié)核菌素皮膚試驗：即OT/PPD皮試。---反映體內(nèi)細(xì)胞免疫功能水平。

以遲發(fā)型超敏反應(yīng)檢測細(xì)胞免疫功能。1094、皮膚試驗（體內(nèi)實驗）5