摘要用超聲波-微波協(xié)同萃取法提取檸檬中的活性物質(zhì)，根據(jù)對氨基苯磺酸-鹽酸萘乙二胺分光光度法測定檸檬對亞硝酸鹽的清除率。在溫度、乙醇濃度、物料比和萃取時(shí)間等單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，探究提取液劑量、清除時(shí)間和清除溫度對清除率的影響，確定檸檬清除亞硝酸鹽的最佳條件，并此條件下對檸檬果肉和皮的清除率進(jìn)行比較。最后將最佳方案應(yīng)用于實(shí)際樣品中。檸檬含水量為85.96%。在確定提取條件時(shí)發(fā)現(xiàn)，乙醇濃度對清除率影響最大，之后依次依為物料比、提取溫度，最后是提取時(shí)間。當(dāng)乙醇濃度為100%，物料比為1:3，提取溫度為70℃，提取時(shí)間為60s時(shí)，最佳清除率達(dá)74.47%。在確定清除條件時(shí)發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)溫度對清除率影響最大，其次為反應(yīng)時(shí)間，提取液用量對其影響最小。當(dāng)反應(yīng)溫度為50℃，反應(yīng)時(shí)間為5min，提取液用量為7mL時(shí)，最佳清除率達(dá)91.35%。檸檬提取液對實(shí)際樣品中亞硝酸鹽的清除率最高可達(dá)85.52%，最低為64.56%。關(guān)鍵詞：檸檬提取液；亞硝酸鹽；清除率；亞硝胺AbstractSynergisticextractionimmersedinethanolusingultrasonicmicrowaveactiveingredientoflemon.Theremovalrateofnitritewasdeterminedbyspectrophotometricdeterminationofaminobenzenesulfonicacidandnaphthalene.Onthebasisofsinglefactorssuchastemperature,ethanolconcentration,materialratioandextractiontime,exploringtheeffectofextractdosage,clearancetimeandclearancetemperatureonclearancerate,determiningthebestconditionsforlemonremovalofnitriteandcomparingtheclearancerateoflemonpulpandskininthiscondition.Finally,thebestsolutionisappliedtotheactualsample.Thelemonwatercontentis85.96%.Whendeterminingtheextractionconditions,itwasfoundthattheconcentrationofethanolhadthegreatestinfluenceonclearancerate,followedbymaterialratio,extractiontemperature,andfinallyextractiontime.Whentheconcentrationofethanolwas100%,thematerialratioof1:3,extractiontemperaturewas70℃,60sforextractingtime,thebestclearanceratewas74.47%.Whendeterminingtheclearanceconditions,thereactiontemperaturehasthegreatestinfluenceonclearancerate,followedbythereactiontime,andtheextractamounthastheleastinfluenceonit.Whenthereactiontemperaturewas50℃,thereactiontimewas5min,theamountoftheextractwas7mL,theoptimalclearanceratewas91.35%.Theremovalrateofnitriteintheactualsamplewasupto85.52%,andthelowestwas64.56%.KeywordsLemonextractNitriteTheclearanceNitrosamine1緒論1.1檸檬1.1.1檸檬的種類檸檬的起源至今未知，但普遍認(rèn)為是緬甸北部、印度南部和中國，其果實(shí)為淺黃色或黃色、橢圓形，味酸。檸檬的種類豐富，有尤力克、菲諾、維爾拉、印度大果、維拉法蘭卡、里斯本、熱那亞、北京檸檬、費(fèi)米奈勞等，其中高酸的是菲諾和費(fèi)米奈勞，低酸的為北京檸檬。其中我國的檸檬主要分布在長江以南地帶，而因盛產(chǎn)檸檬被譽(yù)為“中國檸檬之鄉(xiāng)”的是四川安岳。1.1.2檸檬的營養(yǎng)成分及價(jià)值檸檬富含維生素C、維生素B1、維生素B2、檸檬酸、蘋果酸、檸檬希及鈣、磷、鐵等多種元素[1]。檸檬因其富含各種營養(yǎng)物質(zhì)，并具有獨(dú)特的風(fēng)味，故兼具藥用價(jià)值和食用價(jià)值。檸檬對于人體的血液循環(huán)以及鈣質(zhì)的吸收有相當(dāng)大的幫助，其豐富的維他命C不但能夠預(yù)防癌癥、降低膽固醇、食物中毒，消除疲勞，增加免疫力，延緩老化，保持肌膚彈性，并且克服糖尿病、高血壓、貧血、感冒、骨質(zhì)疏松癥，等[2]。如果缺少維他命C，細(xì)胞間膠狀物也會(huì)減少，會(huì)使細(xì)胞組織變脆，并使其抵抗外力的能力變?nèi)酰瑥亩忌蠅难Y。新鮮檸檬皮片還能有效的緩解胃外科術(shù)后患者頭暈、惡心感,減輕患者痛苦[3]。在食物烹飪的過程中，檸檬常用作調(diào)味劑，增加食物的風(fēng)味，促進(jìn)食用者的食欲。檸檬還具有抗氧化活性，對冷鮮肉具有一定的保鮮效果[4]。1.1.3檸檬加工產(chǎn)品目前檸檬鮮果加工主要以生產(chǎn)檸檬干片和果汁飲料制造為主[5]。因檸檬能夠防止皮膚色素沉著、延緩老化、降低膽固醇、保持肌膚彈性等功效，故較受大家歡迎，特別是年輕女性，為了方便大家食用，就產(chǎn)生了檸檬干片。檸檬干片中的營養(yǎng)成分雖不如鮮檸檬多，但將干檸檬片泡水，其功效也差不多，都能美白、防治心血管疾病和腎結(jié)石、提高免疫力、祛痰（其祛痰功效較橙和柑橘強(qiáng)）等。檸檬干片的制作工藝一般為烘干、自然風(fēng)干、微波真空干燥等，前兩種是目前市面上較常用的檸檬干燥法。檸檬果汁飲料具有其獨(dú)特的清香，在市場上較受歡迎。檸檬果汁類似薄荷給人以醒腦的感覺，但其口感又是清爽的，非常獨(dú)特。以梨-檸檬為例，其制作工藝為清洗、破碎、打漿取汁、澄清處理、加入檸檬、成分調(diào)劑、主發(fā)酵、陳釀、去漿澄清、殺菌、灌裝、封蓋、成品[7]。因其具有特殊的香味，甚至在香水和化妝品等行業(yè)也有所應(yīng)用[6]。例如檸檬防曬乳液、檸檬洗面奶、檸檬香精油等。1.1.4檸檬的生理功能檸檬中含有較多的活性物質(zhì)，且大多都有益于身體健康，所以檸檬又被稱為益母果。檸檬精油能抗菌消炎殺菌，消除體內(nèi)結(jié)石；黃酮類物質(zhì)可消除體內(nèi)多余自由基，預(yù)防癌癥，改善心腦血管疾??；果酸具有減肥、抗凝血、解毒、解酒的功效；檸檬苦素可以抑制腫瘤、抗焦慮、降膽固醇、利尿、改善心腦血管循環(huán)、調(diào)節(jié)細(xì)胞色素沉淀、改善睡眠；膳食纖維能改善便秘，消除重金屬中毒；VC有助于膠原蛋白的合成，抗氧化，抗壞血病。另外檸檬也是味中藥，常用于和胃安胎、生津解暑、妊娠嘔吐。檸檬具有減肥、降低膽固醇、調(diào)節(jié)細(xì)胞色素沉淀、抗氧化、改善心腦血管疾病等各種功能?！霸掠瘎t滿，水滿則溢”，檸檬雖好，過猶則不及，要做到合理利用，例如不能空腹吃檸檬，胃酸分泌過多和胃潰瘍患者不宜吃檸檬，因檸檬含糖量不少，糖尿病患者不宜多吃。1.1.5檸檬的產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀檸檬在中國是稀缺資源，僅在我國四川安岳盛產(chǎn)，其余大多靠進(jìn)口，并且日常生活中，因其特有的酸味和苦味，人們用到檸檬的地方并不多。市面上的檸檬產(chǎn)品大多是檸檬干片和檸檬果汁飲料，而檸檬干片經(jīng)過熱燙煩躁等工藝后，其中不少營養(yǎng)成分都損失掉了，檸檬果汁飲料中的有效成分更是少之又少。所以需要我們抓住機(jī)遇，加大研發(fā)力度，開發(fā)更多檸檬深加工產(chǎn)品，推動(dòng)我國檸檬產(chǎn)業(yè)發(fā)展，讓更多的人了解到檸檬的功效，擴(kuò)大檸檬消費(fèi)市場。1.1.6檸檬中活性物質(zhì)的提取方法檸檬主要包括精油、果酸、膳食纖維、黃酮類物質(zhì)、檸檬苦素、VC等成分[8]。1.1.6.1壓榨法壓榨法主要是通過機(jī)械加壓，壓榨出果皮中的有效成分。原料經(jīng)石灰水浸泡、漂洗后壓榨、過濾，將得到的濾液靜置，并再次過濾。此方法成本低，易保持原料原有的結(jié)構(gòu)和功能，但分離較為困難，所得濾液中有效成分含量相對較低。1.1.6.2浸提法浸提法是利用原料中各種成分在溶劑中的不同溶解性，選用對所需提取活性成分溶解度大，對其他成分溶解度小的溶劑，而將所需有效成分從中浸提出來的方法。常用的溶劑可分為水、親本性和親脂性有機(jī)溶劑。用水浸提操作簡單且可節(jié)約成本，但其提取率低且適用的樣品較少。有機(jī)溶劑提取法雖提取率較高，但有的溶劑有毒，例如苯、甲醇、二氯乙烷等，且成本較高，操作繁瑣。楊強(qiáng)[9]采用熱水浸提法提銀杏中非淀粉多糖，實(shí)驗(yàn)表明物料比為25mL/g、溫度為90℃、時(shí)間為5h時(shí)銀杏果多糖的提取率為2.76%。1.1.6.3超聲波-微波萃取法超聲波輔助提取法利用空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)及熱效應(yīng)加強(qiáng)胞內(nèi)物質(zhì)的釋放、擴(kuò)散及溶解[10]。超聲波-微波萃取法具有提取時(shí)間短、提取率高，氧化損耗率低等優(yōu)點(diǎn)。此外，還可降低經(jīng)濟(jì)成本。胡莉等[11]采用微波萃取法來優(yōu)化花生稈中的SDF的提取工藝，發(fā)現(xiàn)檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%、料液比為1mg∶25mL、微波功率為480W、處理時(shí)間為30s為SDF的最優(yōu)提取條件。1.1.6.4水蒸氣蒸餾法水蒸氣蒸餾法適用于有效成分溶于水的原料，其具體方法為將原料與水混合，加熱使其產(chǎn)生蒸汽，再經(jīng)冷凝、油水分離等，提取出有效成分。彭靜[12]等用水蒸氣蒸餾法提取乳香揮發(fā)油，發(fā)現(xiàn)最佳提取工藝為:加水量3倍水、不浸泡、提4h。1.1.6.5超臨界CO2法超臨界CO2法是通過改變壓力和溫度，使其影響超臨界流體的溶解能力，從而依次萃取極性、沸點(diǎn)、分子量不同的成分。超臨界流體不僅具有也液體相似的良好溶劑化能力，又具有與氣體一樣的良好傳質(zhì)化能力[13]。苗笑雨[14]等采用超臨界CO2萃取技術(shù)提取虎掌菌精油，發(fā)現(xiàn)萃取壓力33MPa，萃取溫度55℃，萃取時(shí)間145min為最佳工藝條件。1.2亞硝酸鹽亞硝酸鹽是無機(jī)化合物，主要包括呈白色或淡黃色粉末或顆粒狀的亞硝酸鈉，味微咸，遇水易溶，外觀和味道都與食鹽類似[15]。1.2.1亞硝酸鹽的來源在我們的日常生活中，亞硝酸鹽都普遍存在，例如食品，土壤，飲用水，環(huán)境中等都存在亞硝酸鹽。一些植物體內(nèi)也含有硝酸鹽，不同的品種含量不同，這是由農(nóng)作物栽培，使用含氮農(nóng)藥、含氮肥料造成的。食品中亞硝酸鹽主要來自于肉類食品、蔬菜和水。肉類食品在加工過程中加入一定量的硝酸鹽、亞硝酸鹽即可改善風(fēng)味，穩(wěn)定色澤，抑制肉毒梭菌的生長繁殖，而至今都沒有發(fā)現(xiàn)任何一種添加劑能夠代替亞硝酸鹽的這些功能。因此，亞硝酸鹽使用量、殘留量超標(biāo)事件也時(shí)有發(fā)生。蔬菜中含有亞硝酸鹽主要是在種植過程中過量施用硝態(tài)氮肥；酸菜等腌漬食品在腌漬過程中由于硝酸還原菌的作用，硝酸鹽被還原成亞硝酸鹽；隔夜熟菜、霉變蔬菜等。有些地區(qū)的飲用水中含有較多亞硝酸鹽，用其烹調(diào)食物，并在不潔灶具中放置過久，硝酸鹽極易被還原為亞硝酸鹽。1.2.2亞硝酸鹽的危害亞硝酸鹽作為一種重要的前體物質(zhì)，可與蛋白質(zhì)作用產(chǎn)生高致癌的亞硝胺[16,17]，而亞硝胺是危害性極高的化合物之一[18]。亞硝酸鹽是工業(yè)用鹽,常見的亞硝酸鹽有亞硝酸鈉和亞硝酸鉀,為白色或微黃色的結(jié)晶或顆粒粉末,無臭,味微咸澀稍苦,易潮解,易溶于水,是一種劇毒品。亞硝酸鹽在建筑工地用于水泥防交流劑,鍋爐水的軟化劑,在食品業(yè)用于肉制品的發(fā)色劑,但在國家標(biāo)準(zhǔn)中,肉制品的亞硝酸鹽含量是被限制使用的。由于亞硝酸鹽的外觀很像食鹽,堿面,白糖和發(fā)酵粉,因此常被誤食而引起中毒。亞硝酸鹽作為國家允許的食品添加劑，其純品一般應(yīng)用于肉制品加工，但人體口服300-500mg亞硝酸鹽就可引起食物中毒，超過3g就會(huì)引起死亡。因?yàn)閬喯跛猁}可與血紅蛋白結(jié)合形成高鐵血紅蛋白，使血液失去攜氧功能，其典型的癥狀為口、唇、舌、指甲等青紫，嚴(yán)重的呼吸衰竭而死亡。亞硝酸鹽還可與食品中的胺反應(yīng)，生成N-亞硝胺，導(dǎo)致慢性蓄積性中毒，并可誘發(fā)多部位癌變。1.2.3亞硝酸鹽的應(yīng)用增加風(fēng)味：亞硝酸鹽通過穩(wěn)定脂質(zhì)組成、阻止離子的催化、抑制脂質(zhì)過氧化物降解來增加肉制品的風(fēng)味物質(zhì)。發(fā)色作用：動(dòng)物被宰殺后，因物無氧氣供應(yīng)，代謝在無氧條件下進(jìn)行，從而致使肌肉處于酸性狀態(tài)。亞硝酸鹽在此條件下分解成亞硝基，與肉制品中肌紅蛋白、血紅蛋白形成亞硝肌紅蛋白和亞硝基血紅蛋白。進(jìn)而影響肉制品的色澤?？寡趸饔茫阂蛉饧叭庵破泛兄荆瑯O易在光、熱氧氣、微生物等環(huán)境作用下發(fā)生腐敗變質(zhì)，而亞硝酸鹽能阻止脂質(zhì)氧化，進(jìn)而防止肉及肉制品腐敗變質(zhì)。抑菌作用：亞硝酸鹽能抑制一定的金黃色葡萄球菌、肉毒梭狀芽孢桿菌等致病菌的生長繁殖。李軼欣[19]等通過研究認(rèn)為游離的亞硝酸鹽能夠抑制腌制品中細(xì)菌的生長。當(dāng)使用10～40mg/kg亞硝酸鹽時(shí)，能增加腌肉的風(fēng)味和色澤[20]。傳統(tǒng)腌漬肉存放的時(shí)間較長，更有利于肉毒梭菌的繁殖[21]。肉毒梭狀芽孢桿菌性質(zhì)穩(wěn)定，在高溫高壓下才能被殺死。分布廣泛，繁殖能力強(qiáng)，但游離的亞硝酸鹽能阻斷肉毒素生長。亞硝酸鹽的使用量在10～40mg/kg時(shí)，就能使腌肉產(chǎn)生良好的色澤和風(fēng)味[22]。1.2.4亞硝酸鹽的控制措施亞硝酸鹽有利有弊，雖然毒性大，但價(jià)格低廉、作用強(qiáng)，使其仍然被經(jīng)常運(yùn)用到。我們應(yīng)該盡快找到能替代亞硝酸鹽的物質(zhì)，既能延長食品的保質(zhì)期又對人體的危害降到最低。我們經(jīng)常能在腌制品包裝袋上看到含有亞硝酸鹽的標(biāo)記。如何有效控制亞硝酸鹽的攝入，第一，不食用腐敗變質(zhì)的蔬菜，不食長期置于高溫下的剩菜，不喝蒸鍋剩水。第二，準(zhǔn)確合理控制氮肥的用量，從源頭上解決問題，在食用前進(jìn)行恰當(dāng)?shù)那逑?。第三，對于那些食品加工企業(yè)，制定相關(guān)條例，明確亞硝酸鹽的使用量。第四，注意合理搭配，水果富含維生素C和維生素E以及茶葉都可以殺死亞硝酸鹽還原菌，降低亞硝酸鹽含量。第五，把控添加劑用量，加快研發(fā)尋找替代品。1.2.5亞硝酸鹽的清除因亞硝酸鹽應(yīng)用范圍很廣泛，所以對此的研究也較多，大多為研究從天然物質(zhì)中提取有效成分來清除存在的亞硝酸鹽或阻斷亞硝胺的合成。孫昕[21]等采用酶解法提取生姜中的姜辣素，研究發(fā)現(xiàn)在最佳工藝條件下，姜辣素粗提物對亞硝酸鹽的清除效果可達(dá)99.32%。陶銀華[22]等通過研究發(fā)現(xiàn)海棠果中香豆素類、黃酮類、口山酮類、萜類化合物對亞硝酸鹽有一定清除作用。朱俊玲[23]等通過分光光度法研究發(fā)現(xiàn)番茄、生姜等蔬菜汁和柚子、菠蘿等水果汁對亞硝酸鹽有一定清除作用，且它們的混合汁清除率最低也可達(dá)80.14%。劉星[24]通過研究14中天然植物對亞硝酸鹽的清除作用，發(fā)現(xiàn)多酚在清除過程中起到重要作用。1.3亞硝胺亞硝胺是一類含氮化學(xué)物質(zhì)，具有強(qiáng)致癌性，且較穩(wěn)定，不易分解。1.3.1亞硝胺的來源亞硝胺廣泛存在于我們?nèi)粘Ｉ钪?，包括食物、酒精飲料、飲用水、香煙、化妝品[25]等，其對人體的危害主要分成兩種途徑，一是直接攝入，二是體內(nèi)合成。平時(shí)我們攝入的有些食物是有一定亞硝胺的，特別是腌制食品和發(fā)酵食品，而且有些飲用水中也含有，常以消毒副產(chǎn)物的形式于水處理構(gòu)筑物之中被檢出亞硝胺類物質(zhì)[26]。在食品生產(chǎn)加工過程中使用的包裝材料和容器也會(huì)含有揮發(fā)性亞硝胺，這就是我們直接攝入亞硝胺的原因。胺鹽和亞硝酸鹽是生成亞硝胺的前體物質(zhì)[27]，這些前體物質(zhì)被攝入體內(nèi)后，會(huì)在胃腸道中內(nèi)源性合成亞硝胺。1.3.2亞硝胺的危害亞硝胺具有強(qiáng)致癌性，胃癌和食管癌與N-亞硝胺類化合物脫不了干系。亞硝胺的代謝活化致癌過程[28]為：亞硝胺α位羥基化，在烷化劑（活性中間代謝產(chǎn)物）作用下，脫掉的甲基使鳥嘌呤烷基化，并與烷基的配位鍵結(jié)合，使DNA、RNA復(fù)制錯(cuò)誤，從而導(dǎo)致腫瘤甚至癌癥。1.3.3亞硝胺的阻斷李佳棟[29]等通過制備桂皮、丁香和花椒提取液，對比其對風(fēng)干腸中亞硝胺的阻斷能力，發(fā)現(xiàn)阻斷能力由強(qiáng)到弱的依次是桂皮、丁香和花椒。袁小敏[30]等通過確定小葉苦丁茶的最佳工藝，利用紫外分光光度計(jì)測定阻斷率，發(fā)現(xiàn)葉苦丁茶對亞硝酸鹽有良好的清除效果,對亞硝胺生成有良好的抑制作用。范瑞霞[31]等以超聲波輔助法提取的葡萄果皮提取物為材,分光光度法測定其清除自由基、亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺合成的能力，發(fā)現(xiàn)葡萄果皮提取液具有較強(qiáng)的抗氧化能力,可清除自由基及亞硝酸鹽,阻斷亞硝胺的合成。1.4測定方法1.4.1測定亞硝酸鹽的方法食品中亞硝酸鹽的測定方法有：快速測定管、快速檢測儀、快速測定試劑盒，實(shí)驗(yàn)室定量測定法有離子色譜法和鹽酸萘乙二胺法。具體步驟按照GB5009.33進(jìn)行[32]。其計(jì)算公式為：--------------------------------------------------（1-1）X1:樣品中亞硝酸鈉含量，；A1:通過標(biāo)曲求得試樣中亞硝酸鈉的含量，μg；m:樣品質(zhì)量，；V0:試樣處理液總體積，；V1：測定用試樣體積，。1.4.2測定亞硝胺的方法食品中測定亞硝胺的方法有5種：氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、氣相色譜-熱能分析儀聯(lián)用法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、二次展開光解薄層層析法[33]。具體步驟按照GB5009.26進(jìn)行[34]。1.5意義和內(nèi)容1.5.1意義日常生活中亞硝酸鹽可謂無處不在，因此亞硝酸鹽的清除就至關(guān)重要。檸檬檸檬中含有很多有益身體健康的活性物質(zhì)，利用檸檬來清除食品中的亞硝酸鹽不僅可以增加食品的風(fēng)味，還能有效阻斷亞硝胺的合成，有助于人體飲食健康。1.5.2內(nèi)容本課題以鮮檸檬為研究對象，研究其對亞硝酸鹽起清除作用的生物活性物質(zhì)，采用超聲-微波協(xié)同萃取法提取檸檬中的有效成分，再利用對氨基苯磺酸-鹽酸萘乙二胺分光光度法測定檸檬對亞硝酸鹽的清除率。在溫度、乙醇濃度、物料比和萃取時(shí)間等單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，探究提取液劑量、清除時(shí)間和清除溫度對清除率的影響，確定檸檬清除亞硝酸鹽的最佳條件，在此條件下對檸檬果肉和皮的清除率進(jìn)行比較，并將最佳方案應(yīng)用于實(shí)際樣品中，為進(jìn)一步了解鮮檸檬的性質(zhì)和在工藝生產(chǎn)中更好的利用提供理論基礎(chǔ)。通過對比檸檬對亞硝胺合成的阻斷率，確定其最佳提取液用量和反應(yīng)時(shí)間。2材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)儀器和試樣2.1.1試劑序號名稱規(guī)格廠家四硼酸鈉分析純北京世紀(jì)拓鑫精細(xì)化工有限公司亞鐵氰化鉀分析純湖南和誠醫(yī)藥化學(xué)品有限公司無水對氨基苯磺酸分析純無錫市福晨化學(xué)試劑廠氫氧化鈉粒張家港保稅區(qū)豫東國際貿(mào)易有限公司鹽酸分析純蘭溪市屹達(dá)化工試劑有限公司N-1-萘乙二胺鹽酸鹽分析純無錫市福晨化學(xué)試劑廠7無水乙醇分析純武漢市合中生化制造有限公司8乙酸鋅分析純天津金匯太亞化學(xué)試劑有限公司9亞硝酸鈉分析純無錫市福晨化學(xué)試劑廠10無水碳酸鈉分析純上海東懿化學(xué)試劑公司11二乙胺分析純天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心2.1.2設(shè)備序號名稱型號廠家電子天平XYEB江蘇淮安翔宇電子有限公司恒溫水浴鍋HH-M4上海赫田科學(xué)儀器有限公司臺(tái)式低速離心機(jī)DT5-1北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司4組織搗碎機(jī)FK-A金壇市晨陽電子儀器廠5超聲微波協(xié)同萃取儀SL-SM300南京順流儀器有限公司6可見分光光度計(jì)T6v南京菲勒儀器有限公司7潔凈工作臺(tái)SW-CJ-2G上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠2.1.3材料牛肉棒市售鄉(xiāng)吧佬香雞塊市售鹽津桃肉市售酸辣海帶香菇豆干市售2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1測定檸檬中水分將扁形稱量瓶，洗凈，置于恒溫干燥箱中0.5~1.0h，置于干燥器內(nèi)冷卻0.5h，稱量，并重復(fù)至恒重。將檸檬稱重，切片，厚度約為5mm，置于稱量瓶中于恒溫箱中干燥2~4h后，取出，置于干燥器中冷卻0.5h，取出，稱重，再置于恒溫箱中干燥1h，取出，置于干燥器中冷卻0.5h，取出，稱重，重復(fù)以上步驟，至前后兩次質(zhì)量相差不超過2mg，即為恒重，計(jì)算檸檬含水量。其計(jì)算公式為：含水量（%）=--------------------------------------------------（2-1）m1：稱量瓶和檸檬的質(zhì)量，gm2:稱量瓶和檸檬干燥后的質(zhì)量，gm3:稱量瓶的質(zhì)量，g2.2.2提取檸檬中有效成分將檸檬切塊，剝離檸檬果皮和果肉，分別用組織搗碎機(jī)搗碎。根據(jù)物料比，取適量檸檬碎漿、果皮碎漿或果肉碎漿，用100%無水乙醇浸提，經(jīng)超聲波微波萃取后，用紗布將其過濾，將濾液移入離心管，4000r/min離心20min，取上清液備用。2.2.3測定亞硝酸鹽清除率取六份1.00mL5μg/mL的NaNO2于標(biāo)號為a1、a2、a3、b1、b2、b3的25mL容量瓶中，a1、a2、a3中加適量檸檬提取液，振蕩均勻，靜置反應(yīng)10min，b1、b2、b3中不加提取液，之后a1、a2、a3、b1、b2、b3中都加入4g/L對氨基苯磺酸溶液1mL，振蕩均勻，充分反應(yīng)5分鐘后再都加入2g/L鹽酸萘乙二胺溶液0.5mL，反應(yīng)15分鐘，加100%乙醇溶液定容搖勻，最后再于538nm波長處用1cm石英比色皿測其吸光度，取其平均值，計(jì)算亞硝酸鹽的清除率。其計(jì)算公式為：-----------------------------------------（2-2）Ai：加入檸檬提取液的吸光度A0：未加入檸檬提取液的吸光度因檸檬提取液本身顏色較淺，對清除率的影響不大，故沒有測其吸光度。2.2.3測定亞硝胺阻斷率取六份1.00mL5μg/mL的NaNO2于標(biāo)號為a1、a2、a3、b1、b2、b3的25mL容量瓶中，a1、a2、a3中加適量檸檬提取液，再各加2mL1mmoL二乙胺溶液，以100%乙醇溶液定容，振蕩搖勻，靜置反應(yīng)一定時(shí)間后，吸取1mL反應(yīng)液于小燒杯中，加0.5mL0.5%碳酸鈉溶液，在距液面15cm處用波長254nm紫外燈照射15min，加1.5mL1%對氨基苯磺酸，1.5mL0.1%鹽酸奈乙二胺，0.5mL100%乙醇溶液，混勻靜置15min。在525nm處測其吸光度，計(jì)算亞硝胺的阻斷率。其計(jì)算公式為：--------------------------------（2-3）A0：未加檸檬提取液的吸光度Ai：加檸檬提取液的吸光度Ai’：檸檬提取液本身的吸光度。2.3繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線用1mL移液管依次移取5μg/mL亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液0.00mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.08mL、1.00mL于標(biāo)號為0、1、2、3、4、5的25mL容量瓶中（其中亞硝酸鹽含量分別為0.0μg、1.0μg、2.0μg、3.0μg、4.0μg、5.0μg），分別加入1mL4g/L對氨基苯磺酸溶液，混勻反應(yīng)5min，加入0.5mL2g/L鹽酸萘乙二胺溶液，反應(yīng)15min，加100%乙醇溶液定容搖勻。于538nm波長處用1cm石英比色皿測其吸光度，以標(biāo)號為0的容量瓶中溶液的吸光度為參比。以亞硝酸鈉含量（μg）為橫坐標(biāo)，其對應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線2.4確定最佳提取條件2.4.1物料比分別稱取15g、10g、8g、6g、5g檸檬碎漿，按物料比1:2、1:3、1:4、1:5、1:6加入相應(yīng)體積100%的乙醇溶液，震蕩搖勻，于100W、48℃條件下用超聲波微波協(xié)同萃取儀萃取60s提取有效成分，提取液用紗布過濾，轉(zhuǎn)入離心管，4000r/min離心20min，取上清液備用。按照方法2.2.3進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，繪圖。2.4.2提取時(shí)間稱取30g檸檬碎漿，按物料比1:3加相應(yīng)體積100%的乙醇溶液，振蕩搖勻，于100W、63℃條件下用超聲波微波協(xié)同萃取儀分別萃取30s、60s、90s、120s、150s提取有效成分，提取液用紗布過濾，轉(zhuǎn)入離心管，4000r/min離心20min，取上清液備用。按照方法2.2.3進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，繪圖。2.4.3提取溫度（因該溶液為乙醇溶液，故超聲波微波協(xié)同萃取儀萃取時(shí)溫度最多達(dá)到70℃）按照方法2.2.3進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，繪圖。2.4.4乙醇濃度按照方法2.2.3進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，繪圖2.4.5提取條件的正交選擇物料比、提取時(shí)間、提取溫度和乙醇濃度做正交實(shí)驗(yàn)。表2-1正交實(shí)驗(yàn)因素及水平表4567892.5確定最佳清除條件2.5.1提取液用量取八份1.00mL5μg/mL的NaNO2于標(biāo)號為0、1、2、3、4、5、6、7的25mL容量瓶中，其中標(biāo)號為0的25mL容量瓶不加檸檬提取液，標(biāo)號為1~7的容量瓶用20mL移液管分別移取1mL、3mL、5mL、7mL、9mL、11mL、13mL檸檬提取液，且每份都做3個(gè)平行，振蕩搖勻，靜置反應(yīng)10min，加1mL4g/L對氨基苯磺酸溶液，振蕩均勻，于室溫下充分反應(yīng)5分鐘，加0.5mL2g/L鹽酸萘乙二胺溶液，反應(yīng)15min，加100%乙醇溶液定容搖勻，于538nm波長處用1cm石英比色皿測其吸光度。2.5.2反應(yīng)時(shí)間取六份1.00mL5μg/mL的NaNO2于標(biāo)號為0、1、2、3、4、5的25mL容量瓶中，其中標(biāo)號為0的25mL容量瓶不加檸檬提取液，標(biāo)號為1~5的容量瓶用20mL移液管分別移取7mL檸檬提取液，且每份都做3個(gè)平行，振蕩搖勻，1~5號容量瓶分別靜置反應(yīng)5min、10min、15min、20min、25min，加1mL4g/L對氨基苯磺酸溶液，振蕩均勻，于室溫下充分反應(yīng)5分鐘，加0.5mL2g/L鹽酸萘乙二胺溶液，反應(yīng)15min，加100%乙醇溶液定容搖勻，于538nm波長處用1cm石英比色皿測其吸光度。2.5.3反應(yīng)溫度2.5.4清除條件的正交將提取液用量、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度做正交試驗(yàn)。表2-2正交實(shí)驗(yàn)因素及水平表2.5.5檸檬果皮和果肉的對比取三份1.00mL5μg/mL的NaNO2于標(biāo)號為0、a、b的25mL容量瓶中，其中標(biāo)號為0的25mL容量瓶不加提取液，標(biāo)號為a、b的容量瓶用10mL移液管分別移取7mL檸檬果皮提取液和檸檬果肉提取液，且每份都做3個(gè)平行，振蕩搖勻，于50℃水浴鍋中靜置反應(yīng)5min，加1mL4g/L對氨基苯磺酸溶液，振蕩均勻，于室溫下充分反應(yīng)5分鐘，加0.5mL2g/L鹽酸萘乙二胺溶液，反應(yīng)15min，加100%乙醇溶液定容搖勻，于538nm波長處用1cm石英比色皿測其吸光度。2.6實(shí)際樣品2.6.1處理樣品選擇市售的宏香記牛肉棒、鄉(xiāng)吧佬香雞塊、鹽津桃肉和燒烤味香菇豆干為實(shí)際樣品，分別標(biāo)號為樣品1、樣品2、樣品3和樣品4。具體按照GB5009.33進(jìn)行。2.6.2計(jì)算樣品中亞硝酸鹽含量用20mL移液管移取20mL的濾液于25mL容量瓶中，加1mL4g/L對氨基苯磺酸溶液，反應(yīng)5min，加0.5mL2g/L鹽酸萘乙二胺溶液，反應(yīng)15min，用100%乙醇溶液定容，搖勻，于538nm波長處用1cm石英比色皿測其吸光度，計(jì)算樣品中亞硝酸鹽的含量。2.6.3清除樣品中亞硝酸鹽將市售的宏香記牛肉棒、鄉(xiāng)吧佬香雞塊、鹽津桃肉和燒烤味香菇豆干作為樣品，用組織粉碎機(jī)把樣品攪碎至均勻，稱取適量樣品（其亞硝酸鹽含量與正交優(yōu)化中所使用的亞硝酸鈉含量相同）于25mL容量瓶中，用10mL移液管移取7mL檸檬提取液，在20℃下反應(yīng)40min，按照國標(biāo)法進(jìn)行。2.7確定阻斷亞硝胺合成條件2.7.1提取液用量分別移取3mL、5mL、7mL、9mL、11mL檸檬提取液于25mL容量瓶中，再另準(zhǔn)備一容量瓶，都加1mL5μg/mL亞硝酸鈉，2mL1mmL二乙胺溶液，以100%乙醇溶液定容，振蕩搖勻，靜置反應(yīng)5min，吸取1mL反應(yīng)液于小燒杯中，加0.5mL0.5%碳酸鈉溶液，在距液面15cm處用波長254nm紫外燈照射15min，加1.5mL1%對氨基苯磺酸，1.5mL0.1%鹽酸奈乙二胺，0.5mL100%乙醇溶液，混勻靜置15min。在525nm處測其吸光度，計(jì)算亞硝胺的阻斷率。2.7.2反應(yīng)時(shí)間移取7mL檸檬提取液于25mL容量瓶中，再另準(zhǔn)備一容量瓶，都加1mL5μg/mL亞硝酸鈉，2mL1mmL二乙胺溶液，以100%乙醇溶液定容，振蕩搖勻，分別靜置反應(yīng)3min、5min、7min、9min，吸取1mL反應(yīng)液于小燒杯中，加0.5mL0.5%碳酸鈉溶液，在距液面15cm處用波長254nm紫外燈照射15min，加1.5mL1%對氨基苯磺酸，1.5mL0.1%鹽酸奈乙二胺，0.5mL100%乙醇溶液，混勻靜置15min。在525nm處測其吸光度，計(jì)算亞硝胺的阻斷率。3結(jié)果與分析3.1測定檸檬中水分按照2.2.1中實(shí)驗(yàn)步驟處理，見表3-1表3-1檸檬含水量燒杯質(zhì)量/g檸檬質(zhì)量/g檸檬恒重/g98.9090143.894520.1986含水量（%）85.96提取液含水量（%/mL）21.493.2繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線按照2.3中實(shí)驗(yàn)步驟處理，見圖3-1。圖3-1吸光度和亞硝酸鹽含量的關(guān)系Y=0.0266X-0.0006，相關(guān)系數(shù)為0.9986是標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程。3.3選擇最佳提取條件3.3.1物料比按照2.4.1中實(shí)驗(yàn)步驟處理，見圖3-2圖3-2物料比與清除率的關(guān)系結(jié)論：當(dāng)物料比為1:3時(shí)，清除率最高。當(dāng)物料比超過1：3后清除率有下降趨勢，其原因?yàn)槲锪媳仍酱?，提取液越渾濁，對溶液的吸光度影響越大?.3.2提取時(shí)間按照2.4.2中實(shí)驗(yàn)步驟處理，見圖3-3。圖3-4提取時(shí)間與清除率的關(guān)系結(jié)論：選取60s為最佳提取時(shí)間。清除率隨著提取時(shí)間的增多而提高，但提取時(shí)間對清除率的影響相對小，在60s時(shí)清除率提高相對較大，60s之后趨于平緩，故選取60s為最佳提取時(shí)間。3.3.3提取溫度按照2.4.3中實(shí)驗(yàn)步驟處理，見圖3-4。圖3-3提取溫度與清除率的關(guān)系結(jié)論：當(dāng)提取溫度為70℃時(shí)，清除率最佳。隨著反應(yīng)溫度的增加，清除率越高，但因提取液為乙醇溶液，超聲波微波協(xié)同萃取儀萃取時(shí)溫度最多達(dá)到70℃，故選取最佳提取溫度為70℃。3.3.4乙醇濃度按照2.4.4中實(shí)驗(yàn)步驟處理，見圖3-5。圖3-5乙醇濃度與清除率的關(guān)系結(jié)論：選擇100%為最佳乙醇濃度。當(dāng)用純水作為提取劑時(shí)，提取液過于渾濁，導(dǎo)致無法測其吸光度，影響清除率的計(jì)算，故選取乙醇溶液作為提取劑。隨著乙醇濃度的增加，清除率明顯提高，當(dāng)濃度達(dá)到100%時(shí)，清除率最好，所以選擇100%乙醇溶液作為最佳提取劑。3.3.5提取條件的正交按表2-1，采取L9（34）正交，結(jié)果見表3-2。表3-2正交結(jié)果分析表清除率（%）51.2470.6764.6675.9753.0052.6566.4355.4872.79K162.1964.5553.1259.01K260.5459.7273.1463.2564.9063.3761.3665.374.364.8320.026.36因素主次CDBAC2D3B1A3分析極差可得最優(yōu)為C2D3B1A3，因素主次CDBA。乙醇濃度對清除率影響最大，之后依次依為物料比、提取溫