膿毒癥的功能基因組學與系統(tǒng)生物學研究概述肖獻忠2014年10月23日膿毒癥（sepsis）：指由感染引起的全身炎癥反應綜合征（SIRS），為嚴重感染、創(chuàng)傷、燒傷、休克、大手術(shù)后的常見并發(fā)癥，是ICU病人的首要死亡原因，死亡率高達50％。主要原因：機制復雜（復雜體系）；研究方法局限。SIRS胰腺炎燒傷創(chuàng)傷其他感染膿毒癥嚴重膿毒癥膿毒性休克SIRS、膿毒癥、嚴重膿毒癥、膿毒性休克、MODS之間的關系皮質(zhì)激素內(nèi)毒素抗體TNF-a

抗體、可溶性腫瘤壞死因子受體

IL-1ra

布洛芬

免疫系統(tǒng)TNF-αLPSIL-1花生四烯酸衍生物傳統(tǒng)的治療

膿毒癥的治療mortalitySepticshock53-63%20-53%Severesepsis750,0007-17%sepsis

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2,000,000morbidityMorbidityandmortalityinUSA流行病學資料顯示，膿毒癥的發(fā)生率和病死率呈上升趨勢。全球每年有>1800萬例嚴重膿毒癥患者。據(jù)估計，我國每年膿毒癥約300萬例，死亡約100萬人?；蚪M轉(zhuǎn)錄組蛋白質(zhì)組生理組細胞組織器官個體機體反應的復雜性一、膿毒癥的功能基因組學（FunctionalGenomics）研究轉(zhuǎn)錄組學(transcriptomics)

轉(zhuǎn)錄組（transcriptome）即一個活的有機體（或器官）所能轉(zhuǎn)錄出來的所有mRNA，也稱表達譜，是研究細胞表型和功能的一個重要手段。

轉(zhuǎn)錄組學是研究轉(zhuǎn)錄組及其變化規(guī)律的科學。蛋白質(zhì)組學（proteomics）

蛋白質(zhì)組（proteome）是指一種基因組所表達的全套蛋白質(zhì),即一個有機體的全部蛋白質(zhì)組成及其活動方式。蛋白質(zhì)組學是研究細胞內(nèi)全部蛋白質(zhì)組分及其活動規(guī)律的科學。代謝組學（metabolomics或metabonomics）考察生物體系受刺激或干擾前后代謝產(chǎn)物圖譜及其動態(tài)變化，以揭示生物體系的代謝網(wǎng)絡的科學，研究對象主要是分子量1,000以下的內(nèi)源性小分子。代謝組學具有以下優(yōu)點：基因和蛋白表達的微小變化會在代謝物水平得到放大；(2)代謝組學的研究不需進行全基因組測序或建立大量表達序列標簽(EST)的數(shù)據(jù)庫；(3)代謝物的種類遠少于基因和蛋白的數(shù)目；(4)生物體液的代謝物分析可反映機體系統(tǒng)的生理和病理狀態(tài)。

廣義的相互作用組（interactome）是指一個系統(tǒng)內(nèi)各種分子之間相互作用的總和，包括蛋白質(zhì)與核酸、核酸與核酸、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與生物小分子、核酸與生物小分子、生物小分子與生物小分子之間復雜的相互作用網(wǎng)絡。相互作用組學則是對這個總和的研究。狹義的相互作用組是指蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用。相互作用組學（interactomics）

全基因組表達譜芯片單核苷酸多態(tài)性（SNP）芯片DNA甲基化芯片microRNA芯片Chip-on-chip(染色質(zhì)免疫共沉淀與芯片結(jié)合）二維電泳與質(zhì)譜分析

……高通量技術(shù)（high-throughputtechnologies）膿毒癥功能基因組學研究的主要領域1、病原體的基因組學研究2、膿毒癥易感性與基因多態(tài)性研究3、膿毒癥的轉(zhuǎn)錄組學研究4、膿毒癥的蛋白質(zhì)組學研究5、膿毒癥的相互作用組學研究6、膿毒癥的代謝組學研究1、病原體基因組學研究

隨著基因組測序技術(shù)的進步，許多病原體的基因組測序得以完成，并建立了一系列的數(shù)據(jù)庫，這對于揭示病原微生物的毒力因子及其致病機制，揭示病原體與宿主的相互作用關系，具有重要意義。病原體基因組數(shù)據(jù)庫及其網(wǎng)址Genenameand/ordescriptionFoldincreaseordecreaseandPvalueain:BloodCerebrospinalfluidEpithelialcellcontactFoldchangPFoldchangePFoldchangP

blpU–3.13E-07

cps4A2.22E-03

cps4C3.92E-12

pspA3.42E-0450.31E-084.01E-04

cbpJ3.69E-07

cbpF2.32E-03

blpK–2.53E-06

blpYNANA-16.88E-13NANA

prtA15.57E-069.88E-133.31E-02

lmb3.42E-05–5.21E-09

pln–5.65E-06–9.83E-03

lytA–7.69E-13

chpDNANA12.02E-12

htrANANA8.24E-05DNA芯片分析肺炎球菌的毒力因子在宿主不同部位的差異表達

（OrihuelaCJ,InfectImmun.2004.）2、膿毒癥易感性與基因多態(tài)性(polymorphism)單個核苷酸多態(tài)性(SNPs)：是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，在人群中出現(xiàn)的頻率>1%1.模式識別受體及其相關蛋白

(1).CD14：-159C/T位點，-159T等位基因與膿毒癥的易感性、病死率、TNFα和IL-6水平升高及IL-10水平降低有關（Shock,2007，28(2):148-153)(2).MD-2:-1625C→G與嚴重創(chuàng)傷患者并發(fā)膿毒癥和MOF密切相關（AnnSurg,2007,246(1):151-8)(3).Toll樣受體（TLR）家族：TLR4，+896A→G，+1196C→T等位基因人群患G-菌膿毒癥和膿毒性休克的風險性升高（ClinMedRes,2006,4(4):250-5)2.細胞因子及其受體

(1).TNFα:-308G→A(2).IL-1α:-889C/T，等位基因C與IL-1α高表達相關(3).IL-1受體相關激酶（IRAL-1）的SNP可以影響膿毒癥的預后（AmJRespirCritCareMed.2006.173:1335）

……與膿毒癥風險性密切關聯(lián)的基因多態(tài)性位點

采用DNA芯片分析大鼠盲腸結(jié)扎穿刺的膿毒癥模型中各組織的基因表達。

（AmJPathol2001,159:1199）3、膿毒癥的轉(zhuǎn)錄組學（基因表達譜）研究4、膿毒癥的蛋白質(zhì)組學研究（1）組織器官蛋白質(zhì)組研究（2）尿液蛋白質(zhì)組研究（3）血清蛋白質(zhì)組研究燒傷合并膿毒癥的小鼠骨骼肌蛋白質(zhì)組研究發(fā)現(xiàn)了17個差異蛋白點，主要集中在伴侶蛋白和能量代謝蛋白（BiochemJ，2006,397:149）內(nèi)毒素血癥小鼠肝臟線粒體蛋白質(zhì)組研究發(fā)現(xiàn)ATP合酶α鏈和超氧化物岐化酶表達增高，提示內(nèi)毒素血癥時線粒體存在代償反應。綠色的點代表LPS處理組，紅色的代表對照組，黃色為綠色與紅色中間的過渡色。（FEBSLett.2006,580:1257）膿毒癥（CLP）所致急性腎衰大鼠尿液蛋白質(zhì)組研究發(fā)現(xiàn)，ARF組尿液中白蛋白升高，氨基肽酶升高，絲氨酸蛋白酶抑制物下降。這些蛋白質(zhì)可作為膿毒癥急性腎損傷的生物標志物。紅色代表在ARF中增多的蛋白，綠色代表減少的蛋白，黃色代表未發(fā)生改變的蛋白。（KidneyInt，2006,70:496）膿毒癥患者死亡與存活組血清蛋白質(zhì)組存在差異，發(fā)現(xiàn)6個差異蛋白質(zhì)點。（AnnesthAnalg.2006,103:1522）未去除清蛋白去除清蛋白4hSham4hCLP24hCLP24hSham24hSham24hCLPWithoutPNGaseWithPNGaseCLP小鼠血清蛋白質(zhì)組研究發(fā)現(xiàn)30個差異表達蛋白點，利用N-糖酰胺酶F去除N-連接寡糖后發(fā)現(xiàn)膿毒癥時蛋白質(zhì)的N-糖基化發(fā)生改變。（JProteomeRes.2007,6:2812）5、膿毒癥的相互作用組學研究（1）人類、果蠅、線蟲蛋白質(zhì)相互作用組研究（2）LPS所致炎癥反應的相互作用組研究（Science.302,2003）果蠅蛋白家族與人類疾病相關直系同源蛋白網(wǎng)絡圖（Science.302：5651,2003）蛋白質(zhì)相互作用的亞細胞定位。（Science，2003,302:5651）秀麗線蟲蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡圖（Science，2004,303:5657）采用LPS刺激人巨噬細胞，收集其轉(zhuǎn)錄組、轉(zhuǎn)錄因子的表達、啟動子結(jié)構(gòu)三部分信息并對三部分信息進行整合，繪制了巨噬細胞受LPS刺激后活化機制的相互作用網(wǎng)絡圖，找出4個關鍵的轉(zhuǎn)錄因子（Nrf-2，Atf-3，Ets-1,Irf-1)；并對整體網(wǎng)絡進行分割，整合前人的實驗結(jié)果及數(shù)據(jù)庫資料按刺激時間的先后繪制出20個“subnetwork”（CellImmunol244:105,2006；Genomics88:133,2006）二、膿毒癥的系統(tǒng)生物學（SystemsBiology）研究物理學

物理現(xiàn)象的觀測生命現(xiàn)象的觀測數(shù)學的描述？物理學的描述數(shù)學的描述F＝maE=MC2生命科學生物學的描述經(jīng)驗階段理性階段經(jīng)驗階段理性階段系統(tǒng)生物學概念系統(tǒng)生物學是研究一個生物系統(tǒng)中所有組成成分（基因、mRNA、蛋白質(zhì)等）的構(gòu)成及其在特定條件下的相互關系的科學。它不同于以往的實驗生物學—僅關心個別的基因和蛋白質(zhì)，而要研究所有基因、所有蛋白質(zhì)、所有組分間的所有相互關系。系統(tǒng)生物學是以整體性研究為特征的一種大科學。LeroyHood，2001系統(tǒng)生物學的靈魂——整合

1.系統(tǒng)內(nèi)不同性質(zhì)的構(gòu)成要素（基因、mRNA、蛋白質(zhì)、生物小分子等）的整合；2.從基因到細胞、組織、個體的各個層次的整合；3.研究思路和方法的整合。系統(tǒng)生物學的基礎——信息系統(tǒng)生物學的鑰匙——干涉

1.干涉要有系統(tǒng)性；2.干涉能力需要高通量。系統(tǒng)生物學三要素基因組學轉(zhuǎn)錄組學蛋白質(zhì)組學代謝組學為疾病的診治提供新思路，新方法系統(tǒng)生物學相互作用組學Nature.Vol437:1032,2005系統(tǒng)生物學研究舉例：接受內(nèi)毒素注射的志愿者白細胞基因表達的時程改變及其相互作用網(wǎng)絡Calvano等采用基因芯片檢測接受內(nèi)毒素注射的志愿者白細胞基因表達的時程改變，并從中選擇代表性基因。

根據(jù)前人的研究結(jié)果和各種蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫、相互作用數(shù)據(jù)庫，把人白細胞受LPS刺激后表達發(fā)生改變的基因以及這些基因的相互作用進行匯總，從本實驗中選擇出292個代表性基因，并根據(jù)數(shù)據(jù)庫存在的與這些基因有關的相互作用，構(gòu)建了一個典型的“代表性基因和相互作用網(wǎng)絡”支撐的炎癥細胞模型，同時按時間先后繪制出具有不同表達改變的“時間網(wǎng)絡模型”。

Nature，437:1032,2005

隨后根據(jù)數(shù)據(jù)庫和芯片結(jié)果選擇與內(nèi)毒素血癥相關并且彼此間具有相互作用的1214個基因繪制了大的炎癥網(wǎng)絡，并從中選擇342個具有高密度相互作用的基因進行功能亞群分類，繪制了9個“細胞功能基因網(wǎng)絡模塊”，從而能更直觀以網(wǎng)絡的形式宏觀地觀察內(nèi)毒素血癥過程中基因功能的改變及相互之間的關系。比如框1-9分別代表線粒體呼吸鏈復合體I基因群、線粒體呼吸鏈復合體II基因群、ATP合酶復合體基因群、丙酮酸脫氫酶復合體基因群、線粒體通透孔復合體基因群、延伸起始因子復合體基因群、核糖體蛋白基因群、COP9信使體基因群和蛋白酶體基因群。

Nature.Vol437:1032,2005膿毒癥發(fā)生機制及治療的系統(tǒng)生物學研究動物模型臨床病人生理參數(shù)血清白細胞蛋白質(zhì)組基因組microRNA組轉(zhuǎn)錄因子譜系統(tǒng)生物學分析從系統(tǒng)水平揭示膿毒癥的發(fā)生機制