兩種厚頜魴野生群體的遺傳多樣性差異,漁業(yè)論文厚頜魴(Megalobramapellegrini)俗稱烏鳊,從屬于鯉形目(Cypriniformes)、鯉科(Cyprinidae)、鲌亞科(Cultrinae)、魴屬(Megalobrama)[1],是長江上游特有的經(jīng)濟魚類之一.厚頜魴曾被以為是三角魴(M.terminali)的同種異名,后經(jīng)羅云林[2]對魴屬物種的性狀差異進行具體分析后,將其確立為有效種.然而,近年來,由于棲息地不斷被毀壞、片段化以及過度捕撈等人為因素的影響,厚頜魴的種群數(shù)量處于急劇下降趨勢[3,4].同時,三峽大壩及長江上游梯級電站的陸續(xù)開發(fā)嚴重改變了長江上游的水文環(huán)境,如原來的流水環(huán)境變成靜水環(huán)境,這對厚頜魴這種在繁衍季節(jié)對流水條件要求較為苛刻的物種來講無疑是一種毀壞滅亡性的毀壞[5].據(jù)調(diào)查,當前厚頜魴在長江上游的干流及其大型支流基本絕跡,僅于長江上游的一級支流--龍溪河尚存在種群規(guī)模的野生厚頜魴群體[3],而且研究表示清楚,此水域的厚頜魴種群資源由于過度開發(fā)其資源量仍處于下降趨勢[4].劉軍[6]曾根據(jù)瀕危系數(shù)、遺傳損失系數(shù)和物種價值系數(shù)將魚類的優(yōu)先保衛(wèi)順序劃分為四個級別,厚頜魴已到達三級急需保衛(wèi)物種.生物的遺傳多樣性水平是長期進化的產(chǎn)物,是評估生物資源現(xiàn)在狀況的一個重要參數(shù),遺傳多樣性越高,即遺傳變異越豐富,則對環(huán)境的適應能力就越強,其生存的競爭力就越強.然而,當前關于厚頜魴遺傳多樣性的研究較少.劉煥章和汪亞平[8]基于同功酶標記對厚頜魴合江群體的遺傳多樣性進行了初步評估;Wang等[9]基于微衛(wèi)星標記對厚頜魴龍溪河群體的遺傳多樣性進行了初步評估,得到的結(jié)果均顯示厚頜魴群體的遺傳多樣性水平較低.本研究同時采用核基因標記--微衛(wèi)星標記(Simplese-quencerepeat,SSR)和線粒體標記(MitochondrialDNA,mtDNA)--細胞色素b基因(Cytb)與控制區(qū)(D-loop)序列,分別對龍溪河水域及球溪河水域的厚頜魴野生群體的遺傳多樣性進行比擬分析,試圖從分子水平比擬這兩個厚頜魴野生群體的遺傳多樣性差異,以期為厚頜魴的種群復壯和種質(zhì)資源的合理開發(fā)與利用等保衛(wèi)管理研究提供有價值的科學根據(jù).1材料與方式方法1.1材料本研究中的2個厚頜魴野生群體分別來源于長江上游的一級支流--龍溪河,以及沱江的一級支流--球溪河.華而不實,厚頜魴龍溪河群體(LXH)于2018年不同時段采自四川省瀘州市龍溪河(同Wang等[9]中的野生群體),實驗樣本量(Numberofindividuals,N)共計30尾;厚頜魴球溪河群體(QXH)于2018年10月購自四川省瀘州市龍陽區(qū)漁種站(該群體來源于最近幾年球溪河水域的野生厚頜魴作為親本經(jīng)人工繁衍得到的子一代群體,且親本數(shù)在10對以上,故本研究將其視為野生群體),實驗樣本量(N)共計32尾.上述兩個群體的代表樣本均是隨機取樣,且每尾標本分別取其新鮮肌肉與鰭條于95%酒精中固定,20℃保存?zhèn)溆?1.2基因組DNA的提取樣品基因組DNA的提取采用DNeasyBloodandTissuekit(QIAGEN)試劑盒,詳細步驟參照試劑盒手冊.1.3引物設計及PCR擴增微衛(wèi)星標記:參考Wang等[9]研究中開發(fā)的厚頜魴多態(tài)性微衛(wèi)星標記,本研究共選取10個多態(tài)性相對較高(如多態(tài)信息含量0.5)且未偏離哈迪-溫伯格平衡的微衛(wèi)星標記(MP8、MP14、MP15、MP16、MP17、MP28、MP32、MP40、MP45和MP48)(登錄號分別是:JQ087472、JQ087475、JQ087476、JQ087477、JQ087478、JQ087483、JQ087486、JQ087488、JQ087492、JQ087494).詳細的引物序列、PCR擴增、產(chǎn)物檢測及其記數(shù)等詳見Wang等[9].線粒體標記:Cytb基因片段的引物為通用引物L14724(5-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3)和H15915(5-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3)[10];D-loop片段的引物為本研究設計的厚頜魴特異性引物MP-CR_F(5-CGGTCTTGTAATCCGAAGATCG-3)和MP-CR_R(5-CATGTGTAAGTCGGGTAAGAGCTG-3).PCR反響總體系為25L,華而不實,10Buffer(TaKaRa)2.5L,MgCl2(30mnol/L)1.5L,dNTPs(10mmol/L)2L,上下游引物(10mol/L)各1L,rTaq聚合酶9(TaKaRa)1U,模板DNA100ng.反響條件:94℃預變性2min;隨后30個循環(huán),每一次循環(huán)的參數(shù)設置為94℃變性30s,56℃退火30s,72℃延伸90s;最后72℃終延伸7min.PCR擴增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,然后直接由華大基因(BGI)完成純化回收及雙向測序工作.1.4數(shù)據(jù)分析微衛(wèi)星標記:應用軟件POPGENE1.31[11]、CERVUS3.0.3[12]和Arlequin3.5[13]分別完成對厚頜魴遺傳構(gòu)造的分析,計算的基本參數(shù)主要有:等位基因數(shù)(NumberofAllele,Na)、觀測雜合度(ObservedHeterozygosity,Ho)、期望雜合度(ExpectedHeterozygosity,He)、多態(tài)信息含量(PolymorphicInformationContent,PIC)、哈迪-溫伯格平衡(Hardy-WeinbergEquilibrium,HWE)、遺傳分化指數(shù)(FixationIndex,Fst)和分子方差分析(AnalysisofMolecularVariance,AMOVA)等.線粒體標記:測序獲得的Cytb與D-loop序列集分別由ClustalX軟件[14]、Seaview軟件[15]進行編輯、校正和比對.通過DnaSP5.0軟件[16]統(tǒng)計各群體的單倍型數(shù)(Haplotype,H)、單倍型多樣性指數(shù)(Haplotypediversity,Hd)、變異位點數(shù)(Variablesite,V)、核苷酸多態(tài)樣性指數(shù)(Nucleotidediver-sity,Pi)等.使用Arlequin3.5軟件[13]計算兩兩群體間的Fst值,并進行AMOVA分析.單倍型間遺傳距離通過1000次重抽樣進行顯著性檢驗.單倍型序列由Sequin12.30軟件(NCBI)完成注釋,并提交至GenBank獲取序列號.2結(jié)果2.1厚頜魴龍溪河群體與球溪河群體的遺傳多樣性基于10個微衛(wèi)星標記計算出的厚頜魴龍溪河群體與球溪河群體的遺傳多樣性結(jié)果如表1所示.龍溪河群體所檢測到的微衛(wèi)星平均等位基因數(shù)為3.8個,平均觀測雜合度為0.63,平均期望雜合度為0.62,平均多態(tài)信息含量為0.54,其遺傳多樣性呈中等水平.而與龍溪河群體相比,球溪河群體的遺傳多樣性與之相當,如:平均等位基因數(shù)為3.7個,平均觀測雜合度為0.64,平均期望雜合度為0.64,多態(tài)信息含量為0.55.除此之外,10個微衛(wèi)星標記中有5個位點(MP16、MP17、MP28、MP40和MP45)在球溪河群體中顯著或極顯著地偏離了哈迪-溫伯格平衡(P0.05).基于線粒體標記計算出的兩個厚頜魴野生群體的遺傳多樣性結(jié)果如表2所示.經(jīng)比對得到的Cytb片段與D-loop片段的大小分別為1121和937bp,均無插入、缺失.Cytb片段在兩個野生群體(共計62個個體)檢測到4個變異位點,2種單倍型(Ha1、Ha2);華而不實,在龍溪河群體的30個個體中只檢測到一種單倍型(Ha1;GenBank登錄號KC425463),因而,單倍型多樣性指數(shù)(Hd)、變異位點數(shù)(V)、核苷酸多樣性指數(shù)(Pi)均為0,顯示其遺傳多樣性水平極低;而在球溪河群體中除了擁有Ha1單倍型(GenBank登錄號KC425464)外,還檢測到第2種單倍型(Ha2;GenBank登錄號KC425465),表現(xiàn)出的多樣性比龍溪河群體略高(Hd=0.272,V=4,Pi=0.00097).與Cytb片段相比,D-loop片段表現(xiàn)出更高層次的序列變異,在兩個群體(共計62個個體)檢測到19個變異位點,組成6種單倍型;華而不實,在龍溪河群體檢測到2種單倍型(Ha1、Ha2;GenBank登錄號分別為KC425466和KC425467),在球溪河群體檢測到5種單倍型(Ha1、Ha3、Ha4、Ha5、Ha6;GenBank登錄號KC425468-KC425472).與Cytb的結(jié)果類似,D-loop片段的計算結(jié)果同樣顯示厚頜魴球溪河群體的遺傳多樣性水平比龍溪河群體的遺傳多樣性高(龍溪河群體:H=2,Hd=0.239,V=3,Pi=0.00077;球溪河群體:H=5,Hd=0.423,V=15,Pi=0.00243).2.2厚頜魴龍溪河群體與球溪河群體的間遺傳分化分別基于微衛(wèi)星標記與線粒體DNA標記(Cytb和D-loop)對厚頜魴龍溪河群體與球溪河群體間的遺傳分化進行分子方差分析(AMOVA)、遺傳分化指數(shù)(Fst)計算,并進行顯著性檢驗(表3).結(jié)果表示清楚,遺傳變異主要發(fā)生在群體內(nèi)(87.62%-91.66%)而非群體間,且龍溪河群體與球溪河群體間存在顯著的遺傳分化(Fst=0.083-0.124,P0.05).3討論3.1遺傳標記的選擇DNA分子標記是基因的直接反響,不受環(huán)境和其他因素的影響,無組織特異性,不受基因表示出與否的影響,具有數(shù)量豐富、多態(tài)性強及操作簡便等特點.華而不實,微衛(wèi)星標記與線粒體DNA由于突變速率快、多態(tài)性高等特性已被廣泛應用于種群遺傳構(gòu)造等方面的研究[17-19].在本研究中,10個微衛(wèi)星標記與D-loop片段在兩個群體中分別表現(xiàn)出多態(tài),但與之相比,Cytb基因片段在野生群體的30個個體中沒有檢測到變異位點,在球溪河群體的32個個體中也只檢測到4個變異位點,2個單倍型.理論上,D-loop作為一個非編碼區(qū)所承受的選擇壓力較蛋白編碼基因Cytb要小的多(即約束力相對小),通常情況下,D-loop片段的進化速率普遍要高于Cytb基因的進化速率,如McMillan和Palumbi[20]曾指出蝴蝶魚的D-loop片段的進化速率非?？?是Cytb序列進化速率的33-43倍.因而,本研究選擇的微衛(wèi)星標記與D-loop片段較Cytb片段更合適作為檢測厚頜魴群體遺傳變異的有效標記.3.2哈迪-溫伯格平衡本研究采用的10個微衛(wèi)星標記中有5個位點(MP16、MP17、MP28、MP40和MP45)在球溪河群體中顯著或極其顯著地偏離了哈迪-溫伯格平衡(表1).在種群遺傳學研究中,經(jīng)常會出現(xiàn)偏離哈迪-溫伯格平衡的現(xiàn)象,主要原因有華倫德效應(Wahlundeffect)、近親交配(inbreeding)、無效等位基因(Nullalleles)等致使的雜合度缺乏等[21].在球溪河群體中,位點MP16、MP17、MP28及MP40存在純合子過?，F(xiàn)象(HoHe),而在位點MP45則存在著雜合子過剩現(xiàn)象(HoHe).而球溪河群體源自于人工繁衍的子一代,有限的親本數(shù)量很可能導致近親交配,這就不難理解為何在球溪河群體中有5個位點都偏離哈迪-溫伯格平衡.3.3遺傳多樣性厚頜魴是我們國家長江上游地區(qū)的特有魚類,具有重要的生態(tài)價值和遺傳價值.本研究初次采用微衛(wèi)星標記和線粒體DNA標記(Cytb和D-loop)對龍溪河和球溪河水域的厚頜魴野生群體的遺傳多樣性進行了評估.華而不實,微衛(wèi)星標記的分析結(jié)果顯示,與長江上游其他特有物種相比,如圓口銅魚(Coreiusguichenoti)[22]、稀有鯽(Gobiocyprisrarus)[23]、巖原鯉(Procyprisrabaudi)[24],厚頜魴龍溪河群體與球溪河群體的遺傳多樣性均處于中等偏低水平.而從線粒體DNA分析的結(jié)果來看,兩個群體的單倍型多樣度(Hd)與核苷酸多樣度(Pi)均較小(Hd0.5,Pi0.5%),暗示厚頜魴自然群體最近可能經(jīng)歷過瓶頸效應(Bottleneckeffect)[25].除此之外,線粒體DNA數(shù)據(jù)的分析結(jié)果顯示球溪河群體較龍溪河群體的遺傳多樣性更高層次.用于本研究中的厚頜魴球溪河群體來自于球溪河親本人工繁衍的子1代,固然球溪河水域尚有厚頜魴的蹤影,但卻很難再捕撈到種群規(guī)模的厚頜魴樣本.由此可見,即便當前棲息于球溪河水域的野生厚頜魴數(shù)量極其有限,但仍保存著略高于龍溪河水域厚頜魴的遺傳多樣性.因而,源于球溪河水域的野生厚頜魴較龍溪河水域的野生厚頜魴更適用于人工繁衍,對其種群資源的復壯具有更顯著的價值.3.4遺傳分化遺傳分化指數(shù)Fst是揭示群體間遺傳分化程度的重要參數(shù).本研究基于微衛(wèi)星標記、Cytb和D-loop片段計算出的厚頜魴龍溪河群體與球溪河群體間的遺傳分化指數(shù)分別為0.083、0.124和0.090,根據(jù)Wright[26]對Fst值的劃分顯示,本研究中的這兩個野生厚頜魴群體間存在著中等程度的遺傳分化.我們分析存在這一現(xiàn)象的主要原因是地理阻隔,由于龍溪河河口上游存在一個天然懸崖,構(gòu)成了龍溪河和長江干流之間的天然阻隔[3],進而導致龍溪河水域的厚頜魴群體與球溪河(沱江一級支流)水域的厚頜魴野生群體難以進行基因溝通.總之,根據(jù)本研究的結(jié)果,我們以為在野生厚頜魴資源一時難以大量發(fā)現(xiàn)和獲取的現(xiàn)在狀況下,現(xiàn)有來自于球溪河的野生群體和人工繁衍子一代群體具有重要的保衛(wèi)和利用價值.以下為參考文獻:[1]DingRH.FishesofSichuan[M].Chengdu:SichuanScienceandTechnologyPress.1994,238-240[丁瑞華.四川魚類志.成都:四川科學技術出版社.1994,238-240][2]LuoYL.ArevisionoffishesofthecyprinidgenusMegalo-brama[J].ActaHydrobiologicalSinica,1990,14(2):160-165[羅云林.魴屬魚類的分類整理.水生生物學報,1990,14(2):160-165][3]LiWJ.ResearchonthebiologyandecologyofMegalo-bramapellegrini,anendemicfishoftheupperYangzeRiver[D].PhDdissertation.HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan.2006[李文靜.厚頜魴的個體生物學和種群生態(tài)研究.博士學位論文,華中學業(yè)大業(yè),武漢.2006][4]GaoX,TanDQ,LiuHZ,etal.ExploitationstatusandconservationofapopulationofMegalobramapellegriniinLongxiRiverintheupperYangzerRiverBasin[J].SichuanJournalofZoology,2018,28(3):329-333[高欣,譚德清,劉煥章,等.長江上游龍溪河厚頜魴種群資源的利用現(xiàn)在狀況和保衛(wèi).四川動物,2018,28(3):329-333][5]CaoWX.ThenaturereserveconstructionfortheendemicfishesintheupperYangtzeRiverandtherelatedproblems[J].ResourcesandEnvironmentintheYangtzeBasin,2000,9(2):131-132