分子生物學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室

技術(shù)要求與質(zhì)量控制國(guó)家質(zhì)檢總局動(dòng)植物檢疫實(shí)驗(yàn)所二OO四年六月實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求總體要求質(zhì)量控制質(zhì)量保證實(shí)驗(yàn)室總體要求實(shí)驗(yàn)室分區(qū)要求實(shí)驗(yàn)室工作人員要求安全防護(hù)廢棄物處理結(jié)果判斷與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室分區(qū)要求

—設(shè)施和環(huán)境要求

各工作區(qū)域設(shè)置緩沖間，緩沖間的壓力為負(fù)壓（或上設(shè)抽風(fēng)裝置），與其相連的工作間為正壓，工作間與緩沖間之間宜安裝磁性連鎖裝置。不同功能的核酸檢驗(yàn)工作區(qū)應(yīng)是分隔獨(dú)立的工作室，并有明顯的標(biāo)志，各區(qū)間不能直通。各區(qū)之間如果是緊密相連，需安裝物品傳遞艙。每個(gè)工作區(qū)域的頂部應(yīng)安裝紫外燈，紫外燈的波長(zhǎng)為254nm，安裝數(shù)量為每20m2安裝一支40W的紫外燈，燈與地面的距離不宜超過(guò)（2.0±0.1）m。實(shí)驗(yàn)室分區(qū)要求

—工作區(qū)域的設(shè)置及要求核酸檢驗(yàn)區(qū)試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū);樣品制備區(qū);核酸制備區(qū)擴(kuò)增區(qū);擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)蛋白質(zhì)檢驗(yàn)區(qū)蛋白質(zhì)分離純化區(qū)蛋白質(zhì)檢測(cè)區(qū)其它區(qū)域

設(shè)置洗滌消毒室（洗滌、消毒、制備純水和/或雙蒸水、制冰等）、高速/超高速離心機(jī)室、低溫/超低溫冰箱室等。主要功能：原裝試劑和配制試劑的貯存，所有試劑的配制與分裝。工作區(qū)域的壓力要求：未設(shè)緩沖間的試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)，工作區(qū)域?yàn)檎龎?。注意事?xiàng)：當(dāng)試劑經(jīng)質(zhì)檢合格后，應(yīng)將其分裝貯存?zhèn)溆?，貯存試劑的分裝體積根據(jù)通常在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)一次測(cè)定所需的擴(kuò)增反應(yīng)數(shù)決定。用于擴(kuò)增的試劑應(yīng)冰凍貯存。核酸檢驗(yàn)區(qū)各區(qū)功能—試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)核酸檢驗(yàn)區(qū)各區(qū)功能—樣品制備區(qū)主要功能：實(shí)驗(yàn)室樣品的混樣和測(cè)試樣品的制備。工作區(qū)域的壓力要求：未設(shè)緩沖間的樣品制備區(qū)，工作區(qū)域?yàn)樨?fù)壓或減壓，可安裝排風(fēng)系統(tǒng)。注意事項(xiàng)：此區(qū)應(yīng)遠(yuǎn)離其它實(shí)驗(yàn)操作區(qū)；粉碎樣品時(shí)的器皿應(yīng)單獨(dú)使用，所用的器具在使用前應(yīng)經(jīng)過(guò)徹底清洗并高壓消毒，防止交叉污染；稱取的測(cè)試樣品應(yīng)加蓋后再移至樣品核酸制備區(qū)。核酸檢驗(yàn)區(qū)各區(qū)功能—核酸制備區(qū)主要功能：核酸的提取純化與貯存；核酸含量的測(cè)定；測(cè)試樣品DNA的保存。工作區(qū)域的壓力要求：未設(shè)緩沖間的核酸制備區(qū)，工作區(qū)域?yàn)樨?fù)壓或減壓，可安裝排風(fēng)系統(tǒng)。注意事項(xiàng)：已純化的核酸應(yīng)保存于－20℃或－80℃，避免反復(fù)凍融；陽(yáng)性和陰性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)DNA可調(diào)整至常用的使用濃度后分裝并冷凍保存。核酸檢驗(yàn)區(qū)各區(qū)功能—擴(kuò)增區(qū)主要功能：PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的配制和模板的加入，核酸擴(kuò)增。工作區(qū)域的壓力要求：未設(shè)緩沖間的擴(kuò)增區(qū)，工作區(qū)域?yàn)樨?fù)壓或減壓，可安裝排風(fēng)系統(tǒng)。注意事項(xiàng)：嚴(yán)格限制無(wú)關(guān)人員出入并減少在本區(qū)內(nèi)走動(dòng)；加樣應(yīng)在超凈工作臺(tái)（生物安全柜）內(nèi)進(jìn)行，超凈工作臺(tái)的氣流方向宜選擇垂流式；巢式PCR的第二次加樣必須在此區(qū)進(jìn)行。核酸檢驗(yàn)區(qū)各區(qū)功能—擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)主要功能：擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)定工作區(qū)域的壓力要求：未設(shè)緩沖間的擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)，工作區(qū)域?yàn)樨?fù)壓或減壓，應(yīng)安裝排風(fēng)系統(tǒng)。。注意事項(xiàng)：此區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來(lái)源，應(yīng)遠(yuǎn)離其它實(shí)驗(yàn)操作區(qū)；使用PCR-ELISA方法檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，應(yīng)使用洗板機(jī)洗板。若實(shí)驗(yàn)僅采用全自動(dòng)擴(kuò)增檢測(cè)儀（如實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀），可將擴(kuò)增區(qū)與擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)合并為一個(gè)區(qū)。蛋白白質(zhì)質(zhì)檢檢驗(yàn)驗(yàn)區(qū)區(qū)—功功能能及及要要求求蛋白白質(zhì)質(zhì)分分離離純純化化區(qū)區(qū)主要要功功能能：：用用于于蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)的的分分離離與與純純化化。。工作作區(qū)區(qū)域域要要求求：：蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)純純化化應(yīng)應(yīng)具具備備低低溫溫工工作作的的場(chǎng)場(chǎng)地地，，如如4℃℃冷冷房房和和/或或?qū)訉游鑫龉窆竦鹊?。。蛋白白質(zhì)質(zhì)分分離離純純化化區(qū)區(qū)主要要功功能能：：蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)分分析析檢檢測(cè)測(cè)controltest陽(yáng)性結(jié)果陰性結(jié)果檢測(cè)測(cè)工工作作流流程程實(shí)驗(yàn)驗(yàn)室室樣樣品品到到樣樣驗(yàn)驗(yàn)收收（（確確定定是是否否具具備備檢檢驗(yàn)驗(yàn)的的基基本本條條件件））混樣獲取測(cè)試樣樣品à測(cè)試試樣品的制制備（待檢檢狀態(tài)）核酸和/或或蛋白等目目標(biāo)物質(zhì)的的提取PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)（包括擴(kuò)擴(kuò)增和產(chǎn)物物分析）和和/或蛋白白質(zhì)檢測(cè)結(jié)果判定結(jié)果表述（（出具檢驗(yàn)驗(yàn)報(bào)告）實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量量控制和質(zhì)質(zhì)量保證－工作人員員操作要求求按照ISO/IEC17025：1999中中5.2的的要求。應(yīng)具備良好好的分子生生物學(xué)專業(yè)業(yè)技術(shù)操作作規(guī)范。方向：試劑劑貯存和準(zhǔn)準(zhǔn)備區(qū)樣本制備區(qū)區(qū)核酸制備區(qū)區(qū)擴(kuò)增區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物分分析區(qū)各實(shí)驗(yàn)區(qū)域域應(yīng)有專用用的儀器設(shè)設(shè)備，同一一區(qū)域內(nèi)的的儀器設(shè)備備、物品和和工作服應(yīng)應(yīng)有明顯標(biāo)標(biāo)記，避免免與其他區(qū)區(qū)域的儀器器設(shè)備混用用。儀器設(shè)備的的校準(zhǔn)應(yīng)符符合ISO/IEC17025：1999中中5.5的的規(guī)定。實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量量控制和質(zhì)質(zhì)量保證－儀器設(shè)備備要求實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量量控制和質(zhì)質(zhì)量保證－試劑要求求除另有規(guī)定定外，所有有實(shí)驗(yàn)使用用的試劑等等級(jí)應(yīng)為不不含DNA和DNase的分分析純或生生化試劑。。試劑的選選購(gòu)、驗(yàn)收收、貯存應(yīng)應(yīng)符合ISO/IEC17025：：1999規(guī)定。實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)應(yīng)符合GB6682-92中一級(jí)水水的規(guī)格。。去離子水水的電阻應(yīng)應(yīng)達(dá)到18.2Ω。。商品試劑盒盒應(yīng)注明到到貨日期，，對(duì)所收到到的試劑盒盒應(yīng)按規(guī)定定的貯存條條件存放。。對(duì)菌種、質(zhì)質(zhì)粒、動(dòng)植植物細(xì)胞組組織的貯存存與保管應(yīng)應(yīng)符合ASTME1342-97的規(guī)定。。實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量量控制和質(zhì)質(zhì)量保證－試劑配制制實(shí)驗(yàn)室配制制的試劑應(yīng)應(yīng)在容器上上標(biāo)明試劑劑名稱、濃濃度、配制制時(shí)間、保保存條件、、失效日期期及配制者者姓名。所用試劑溶溶液宜大體體積配制、、小體積分分裝后高壓壓滅菌保存存，不宜高高壓滅菌的的試劑應(yīng)過(guò)過(guò)濾（0.22μμm）除菌菌；PCR主混液、、引物、探探針應(yīng)避免免反復(fù)凍融融。實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量量控制和質(zhì)質(zhì)量保證－試劑配制制實(shí)驗(yàn)室應(yīng)確確定關(guān)鍵試試劑，并在在使用前進(jìn)進(jìn)行質(zhì)量檢檢測(cè)。關(guān)鍵鍵試劑包括括：核酸提提取試劑、、RNase、蛋白白酶K、陰陰性對(duì)照標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、、陽(yáng)性對(duì)照照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)、Taq酶、各種種限制性內(nèi)內(nèi)切酶、引引物、探針針、菌種、、陽(yáng)性質(zhì)粒粒。試劑質(zhì)檢包包括①有無(wú)無(wú)污染，是是否存在假假陽(yáng)性；②②使用弱陽(yáng)陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)檢檢測(cè)試劑的的擴(kuò)增效果果。實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量量控制和質(zhì)質(zhì)量保證－防止污污染嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)室室分區(qū)對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)進(jìn)行功能分分區(qū)，各區(qū)區(qū)的工作服服、實(shí)驗(yàn)用用具和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)記錄本應(yīng)應(yīng)區(qū)分標(biāo)記記，不能混混用。樣品管理送檢樣品的的包裝應(yīng)完完好并有明明確的標(biāo)識(shí)識(shí)；在對(duì)實(shí)實(shí)驗(yàn)室樣品品進(jìn)行混樣樣、測(cè)試樣樣品的制備備和稱量過(guò)過(guò)程中應(yīng)避避免交叉污污染。實(shí)驗(yàn)過(guò)程的的質(zhì)量控制制實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量量控制和質(zhì)質(zhì)量保證－實(shí)驗(yàn)過(guò)過(guò)程的質(zhì)量量控制實(shí)驗(yàn)室環(huán)境境對(duì)照陰性質(zhì)控對(duì)對(duì)照核酸提取空空白對(duì)照：：核酸提取取過(guò)程中不不加樣品的的空白管；；PCR試劑劑對(duì)照：不不含DNA/cDNA模板的的PCR擴(kuò)擴(kuò)增反應(yīng)液液試劑；陰性目標(biāo)DNA對(duì)照照：即為內(nèi)內(nèi)源基因?qū)?duì)照，與測(cè)測(cè)試樣品等等同處理。。陽(yáng)性質(zhì)控對(duì)對(duì)照檢驗(yàn)PCR反應(yīng)是否否正常進(jìn)行行PCR抑制制物對(duì)照檢測(cè)PCR反應(yīng)體系系中是否存存在水溶性性抑制物質(zhì)質(zhì)。當(dāng)PCR反應(yīng)無(wú)無(wú)擴(kuò)增結(jié)果果和定量PCR時(shí)宜宜設(shè)此對(duì)照照。實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量量控制和質(zhì)質(zhì)量保證－避免各各類實(shí)驗(yàn)污污染避免擴(kuò)增產(chǎn)產(chǎn)物污染PCR擴(kuò)增增反應(yīng)液中中加入U(xiǎn)DG酶，以以dUTP代替dTTP可防防止以前PCR擴(kuò)增增產(chǎn)物所致致的遺留污污染。避免RNase污染染（RNA檢測(cè)）戴口罩和手手套;DEPC;高溫烘烘烤;RNase抑制劑避免操作過(guò)過(guò)程污染實(shí)時(shí)熒光PCR和總總核酸雜交交法可防止止操作過(guò)程程的污染，，實(shí)時(shí)熒光光PCR尤尤其轉(zhuǎn)基因因產(chǎn)品檢測(cè)測(cè)實(shí)驗(yàn)室重重要的防污污染措施之之一。陽(yáng)性樣品陰性樣品Ct值轉(zhuǎn)基因馬鈴鈴薯和油菜菜籽的實(shí)時(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量量控制和質(zhì)質(zhì)量保證－室間質(zhì)量量評(píng)價(jià)測(cè)試試凡對(duì)外開展展基因檢測(cè)測(cè)并出具檢檢測(cè)報(bào)告的的實(shí)驗(yàn)室，，應(yīng)定期參參加國(guó)家有有關(guān)法定部部門組織的的檢驗(yàn)項(xiàng)目目的室間質(zhì)質(zhì)量評(píng)價(jià)測(cè)測(cè)試。實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量量控制和質(zhì)質(zhì)量保證－實(shí)驗(yàn)室室清潔清潔方向應(yīng)按檢測(cè)工工作流程方方向進(jìn)行：：試劑貯存和和準(zhǔn)備區(qū)樣品粉碎區(qū)區(qū)核酸制備區(qū)區(qū)擴(kuò)增區(qū)產(chǎn)物分析區(qū)區(qū)清潔用具不同實(shí)驗(yàn)區(qū)區(qū)域的清潔潔用具應(yīng)固固定，不能能交叉使用用。工作結(jié)結(jié)束后應(yīng)立立即對(duì)工作作區(qū)域進(jìn)行行清潔。實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量量控制和質(zhì)質(zhì)量保證－實(shí)驗(yàn)室室清潔實(shí)驗(yàn)室空間間實(shí)驗(yàn)室空間間應(yīng)定期進(jìn)進(jìn)行紫外照照射。實(shí)驗(yàn)臺(tái)面和和儀器設(shè)備備的清潔實(shí)驗(yàn)臺(tái)面、、超凈工作作臺(tái)宜用3%雙氧水水或10%次氯酸鈉鈉溶液（含含有效氯1g/L）擦拭清清潔；也可可在擦拭后后再用紫外外光照射，，照射距離離應(yīng)不超過(guò)過(guò)90cm，照射射時(shí)間宜過(guò)過(guò)夜。注：10%次氯酸鈉鈉和3%雙雙氧水應(yīng)在在使用前配配制，配制制好的溶液液不宜長(zhǎng)期期存放。實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量量控制和質(zhì)質(zhì)量保證－有毒有有害及廢棄棄物質(zhì)的處處理移液器吸頭頭使用過(guò)的移移液器吸頭頭應(yīng)放入含含有10%次氯氯酸鈉溶液的容器器內(nèi)浸泡，，浸泡時(shí)間間不宜少于于24h。PCR產(chǎn)物物含有PCR產(chǎn)物的所所有液體及及廢棄物應(yīng)應(yīng)放入含有有1mol/LHCl的容器中浸浸泡，浸泡泡時(shí)間不宜宜少于6h；采用PCR-ELISA方方法檢測(cè)時(shí)時(shí)洗板機(jī)洗洗板所產(chǎn)生生的廢液應(yīng)應(yīng)收集至1mol/LHCl溶液中。瓊脂糖凝膠膠及電泳液液對(duì)含有EB或經(jīng)EB浸泡過(guò)的的瓊脂糖凝凝膠、電泳泳緩沖液的的處理參見見《分子克克隆》。陽(yáng)性樣品和和質(zhì)粒陽(yáng)性質(zhì)粒宜宜放入1mol/LHCl溶液中浸泡泡，浸泡時(shí)時(shí)間不宜少少于6h。實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量量控制和質(zhì)質(zhì)量保證－安全防防護(hù)紫外線應(yīng)佩戴具有有紫外線防防護(hù)功能的的護(hù)目鏡和和/或防護(hù)護(hù)面罩，并并遮蔽暴露露的皮膚。。紫外照射射消毒后由由于空氣中中臭氧富集集，不宜立立即開始工工作，應(yīng)在在停止紫外外照射30min后開始工工作，有條條件的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)室，可安安裝無(wú)臭氧氧紫外燈。。溴化乙乙錠在接觸觸溴化化乙錠錠時(shí)應(yīng)應(yīng)戴一一次性性腈類類手套套，實(shí)實(shí)驗(yàn)操操作宜宜固定定在一一定的的區(qū)間間、使使用相相對(duì)固固定的的容器器。放射線線在做有有放射射性物物質(zhì)的的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)操作作時(shí)應(yīng)應(yīng)遵照照GB11930-89中中的規(guī)規(guī)定進(jìn)進(jìn)行個(gè)個(gè)人防防護(hù)。。細(xì)菌培培養(yǎng)物物細(xì)菌培培養(yǎng)物物及所所接觸觸的平平皿應(yīng)應(yīng)在121℃、、30min消毒毒后方方可丟丟