一、色譜法色譜法：又稱色層法或?qū)游龇?，是一種物理化學(xué)分析方法。它利用不同溶質(zhì)（樣品）與固定相和流動(dòng)相之間的作用力（分配、吸附、離子交換等）的差別，當(dāng)兩相做相對(duì)移動(dòng)時(shí)，各溶質(zhì)在兩相間進(jìn)行多次平衡，使各溶質(zhì)達(dá)到相互分離。葉綠體色素紙層析分離實(shí)驗(yàn)

（紙色譜）1906年，俄國植物學(xué)家茨威特分離植物葉綠體中色素而得名，玻璃管中裝CaCO3,石油醚溶解植物葉綠體倒入管內(nèi)，再用石油醚做淋洗劑，結(jié)果，柱子中被分成幾個(gè)不同顏色的譜帶。二、柱色譜

柱色譜（Columnchromatography)為向玻璃管中填入固定相，以流動(dòng)相溶劑浸潤后在上方倒入待分離的溶液，再滴加流動(dòng)相，因?yàn)榇蛛x物質(zhì)對(duì)固定相的吸附力不同，吸附力大的固著不動(dòng)或移動(dòng)緩慢，吸附力小的被流動(dòng)相溶劑洗下來隨流動(dòng)相向下流動(dòng)，從而實(shí)現(xiàn)分離。

三、色譜法的分類方法

很多，最粗的分類是根據(jù)流動(dòng)相的狀態(tài)將色譜法分成四大類。

色譜法按流動(dòng)相種類的分類：

色譜類型流動(dòng)相主要分析對(duì)象氣相色譜法氣體揮發(fā)性有機(jī)物液相色譜法液體可以溶于水或有機(jī)溶劑的各種物質(zhì)超臨界流體色譜法超臨界流體各種有機(jī)化合物電色譜法緩沖溶液、電場(chǎng)離子和各種有機(jī)化合物

四、

氣相色譜法（GC法）

（一）原理氣相色譜法是采用氣體作為流動(dòng)相的一種色譜法。此法中，載氣（是不與被測(cè)物質(zhì)作用，用來載送試樣的惰性氣體。如氫、氮?dú)猓?。載著被分離的試樣通過色譜柱中的固定相，使試樣各組分分離，然后檢測(cè)。流動(dòng)相——?dú)怏w（由載氣帶著物料氣體）一般用高壓氣瓶供給（N2、He)固定相固體——固體吸附劑液體——擔(dān)體+固定液擔(dān)體：是一種化學(xué)惰性的多孔性固體顆粒。它的作用是提供一個(gè)大的惰性表面，用于承擔(dān)固定液，使固定液以液蠟的狀態(tài)均勻地分布在其表面。實(shí)現(xiàn)色譜分離的先決條件是必須又固定相和流動(dòng)相。色譜柱：在色譜分析法中，內(nèi)有固定相以分離混合組分的柱子（或玻璃管）。固定相：色譜柱內(nèi)不能移動(dòng)的，起分離作用的物質(zhì)；流動(dòng)相：在色譜柱中用于攜帶試樣和洗脫組分的物質(zhì)不同的物質(zhì)在由固定相和流動(dòng)相構(gòu)成的體系中具有不同的分配系數(shù);當(dāng)兩項(xiàng)作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，這些物質(zhì)也隨流動(dòng)相一起運(yùn)動(dòng)，并在兩項(xiàng)間進(jìn)行反復(fù)多次的分配;這樣就使在同一固定相上分配系數(shù)只有微小差別的組分，在固定相的移動(dòng)速度發(fā)生了很大的差別，從而達(dá)到各組分的完全分離。(二）氣相色譜流程示意圖：針形閥載氣轉(zhuǎn)子流量計(jì)汽化室進(jìn)樣器層析柱檢測(cè)器微電流放大器記錄儀電腦載氣凈化器流量計(jì)色譜柱柱箱汽化室檢測(cè)器記錄器進(jìn)樣放空可見261頁（三）氣相色譜儀1、氣相色譜儀的主要部件氣相色譜儀可分為氣路系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢定器、放大記錄系統(tǒng)五個(gè)部分。（1）氣路系統(tǒng)：是一個(gè)載氣連續(xù)運(yùn)行的密閉管路系統(tǒng)。從氣源出來的載氣順次經(jīng)過減壓閥、壓力表、凈化器、氣流調(diào)節(jié)器、轉(zhuǎn)子流量計(jì)、汽化室、色譜柱、檢測(cè)器，然后放空。（2）進(jìn)樣系統(tǒng)包括進(jìn)樣裝置和汽化室。液體進(jìn)樣用微量注射器，汽化室的作用是將液體或固體樣品瞬間汽化為蒸汽。載氣入口接色譜柱散熱片加熱塊汽化室示意圖（3）分離系統(tǒng)：是裝在恒溫箱內(nèi)的色譜柱。他是氣相色譜中的核心部分。色譜柱中裝有固定相。（4）放大系統(tǒng)：將檢測(cè)器轉(zhuǎn)換來的微弱電信號(hào)放大記錄的系統(tǒng)。（5）檢測(cè)器：是關(guān)鍵部件。作用：將經(jīng)色譜柱分離后的各組分按其特性及含量轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的電信號(hào)。按其測(cè)定原理不同分為濃度型檢測(cè)器和質(zhì)量型檢測(cè)器。

2、色譜圖：樣品中各組分經(jīng)色譜過程后，按先后次序進(jìn)入檢測(cè)器，檢測(cè)器就將流動(dòng)相中各組分的濃度(或質(zhì)量)的變化，轉(zhuǎn)變成電壓(或電流)，由記錄器記錄下來，即得到以組分濃度(或質(zhì)量)變化為縱坐標(biāo)，流出時(shí)間為橫坐標(biāo)的信號(hào)－時(shí)間曲線，稱為色譜圖。tRt0從記錄儀得到的色譜圖3、氣相色譜流出曲線有關(guān)術(shù)語保留時(shí)間——從進(jìn)樣到出現(xiàn)組分濃度極大點(diǎn)（色譜峰最高點(diǎn)）的時(shí)間tR在一定固定相，一定操作條件下，各組分的t值不一樣。同一組分有同樣的t值，可用來作定性分析。此外，峰高（h）、峰面積（A）可用作定量分析。A=h×半寬度（峰高一半處色譜峰寬度）A=（底×高）／2A值=積分儀求得總面積的94％。計(jì)算①（一組分峰面積／94％）（總峰面積／94％）②以標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算含量，以含量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)。

某一組分比例=層析柱和檢測(cè)器

1.檢測(cè)器有多種①熱導(dǎo)池檢測(cè)器（TCD）在氣相色譜中應(yīng)用最早、最廣泛的檢測(cè)器。靈敏度為100ppm。原理：不同組分和載氣有不同的導(dǎo)熱系數(shù)。當(dāng)通過熱導(dǎo)池的氣體組成及濃度發(fā)生變化時(shí)，可引起熱敏元件上溫度的變化，由此而產(chǎn)生阻值變化，可衡量組分的含量。②氫火焰離子化檢測(cè)器（FID）靈敏度比熱導(dǎo)池檢測(cè)器高1000倍，可在室溫至300℃范圍內(nèi)使用。原理：以H2（燃燒氣）和空氣（助燃?xì)猓┑幕鹧鏋槟茉?，在氫火焰附近裝置兩個(gè)電極（收集極、發(fā)射極），兩個(gè)電極之間外加100~350V電壓，當(dāng)樣品組分從色譜柱餾出后，由載氣攜帶，與H2匯合，從噴嘴流出，與空氣相遇，經(jīng)引燃就燃燒。在氫火焰高溫能源作用下，樣品組分、電離成正、負(fù)離子，在直流電場(chǎng)的作用下，離子向電極移動(dòng)產(chǎn)生電流，這微小的電流經(jīng)放大器放大后輸入記錄器，得出色譜峰信號(hào)。氫焰檢測(cè)器（與單位時(shí)間內(nèi)進(jìn)入火焰組分的質(zhì)量成正比，是典型的質(zhì)量型檢測(cè)器））對(duì)大多數(shù)有機(jī)物都很靈敏。但對(duì)在氫火焰中不電離的或電離很少的物質(zhì)如N2、NO、CO、CO2、SO2、NH3、H2O、SiCl4、SiF4、HCN等，及無機(jī)物不能用這種檢測(cè)器。③電子捕獲鑒定器（ECD）是一種具有選擇性和靈敏度很高的色譜檢測(cè)器。放射源—以同位素Ni63和3H為β射線放射源，將載氣電離產(chǎn)生正離子和慢速低能量的電子，他們?cè)诤愣ǖ碾妶?chǎng)作用下向極性相反的電極移動(dòng)形成恒定的電流—基始電流。當(dāng)具有電負(fù)性的組分進(jìn)入檢測(cè)器時(shí)，它捕獲了電子，變成帶負(fù)電離子，并與載氣產(chǎn)生的正離子結(jié)合成中性化合物，被載氣帶出檢測(cè)器，結(jié)果使基始電流降低產(chǎn)生信號(hào)，形成峰值。這種檢測(cè)器是對(duì)具有電負(fù)性的物質(zhì)（如含有鹵素、S、P、N的物質(zhì)）產(chǎn)生信號(hào)，且電負(fù)性越強(qiáng)，產(chǎn)生的靈敏度越高，有機(jī)氯農(nóng)藥含有鹵素Cl，所以非常適合。也屬濃度型檢測(cè)器。另外還有火焰光度檢測(cè)器（FPD）測(cè)含S、P化合物，在氫火焰中燃燒測(cè)其中發(fā)光情況。2.層析柱（色譜柱）直徑2~3mm，長1~2m，特殊的達(dá)十幾米，玻璃、尼龍、金屬—有機(jī)氯在高溫下易掛壁，產(chǎn)生催化分解和吸附現(xiàn)象，干擾分析。氣液色譜固定相：擔(dān)體+固定液。要求：擔(dān)體—化學(xué)惰性，與溶質(zhì)之間不起任何化學(xué)作用。買來后往往要自己處理，經(jīng)酸洗水洗至中性，干燥后在硅烷化處理。固定液—常用OV系列，可在350℃下使用，熱穩(wěn)定性好等，都屬硅酮類含甲基、氟等）。要讓固定液很好的涂在但體上。氣相色譜分析法操作條件的選擇

(1)載氣及其流速的選擇載氣種類的選擇一方面要考慮檢測(cè)器的適應(yīng)性,

當(dāng)用熱導(dǎo)檢測(cè)器時(shí)常用N2,H2,He作載氣,當(dāng)用氫火焰離子化檢測(cè)器,火焰光度

檢測(cè)器和電子捕獲檢測(cè)器時(shí)常用N2作載氣.另一方面要考慮載氣流速對(duì)分離時(shí)間和

分離效率的影響,當(dāng)柱和組分一定時(shí),最佳流速可用色譜學(xué)中范氏方程計(jì)算,但在

最佳流速下柱效最高而分析時(shí)間較長,實(shí)際操作時(shí)載氣流速常高于最佳流速.合適

的載氣流速常需通過條件實(shí)驗(yàn)來確定.

(2)柱操作溫度的選擇柱溫直接影響分離效率和分析速度.較高的柱溫能

降低氣相,液相的傳質(zhì)阻力,有利于提高柱效,縮短分析時(shí)間,但使選擇性相應(yīng)降

低;較低的柱溫會(huì)使分析時(shí)間延長.可通過條件實(shí)驗(yàn)來選擇最佳柱溫,其原則是:

既保證各物質(zhì)能達(dá)到良好分離,又不會(huì)使峰形擴(kuò)散,拖尾,同時(shí)還要保證能在較短

時(shí)間內(nèi)完成分離對(duì)于高沸點(diǎn)混合物(300～400℃),使用固定液含量低于3%的色譜

柱和高靈敏度檢測(cè)器時(shí),柱溫一般控制在200～230℃;中等沸點(diǎn)混合物(200～230

℃),固定液含量宜控制在5%～10%,選擇中等柱溫(150～180℃)即可;對(duì)低沸點(diǎn)

混合物(100～200℃),固定液含量宜控制在10%～115%,柱溫則在70～120℃即可;

對(duì)于氣體,氣態(tài)烴類混合物,固定液含量宜控制在15%～25%,在室溫或50℃以下

即可.

(3)進(jìn)樣量的選擇氣化室溫度,柱容量和檢測(cè)器的線性響應(yīng)范圍決定進(jìn)樣

量.對(duì)進(jìn)樣量的要求是:樣品能瞬間氣化,分離效果良好并在檢測(cè)器線性響應(yīng)范圍

之內(nèi).一般液體試樣進(jìn)樣量控制在0.1～10μL,氣體試樣進(jìn)樣量為0.1～10mL.進(jìn)

樣速度越快越好.氣相色譜儀的操作(一)基本操作1、氣體鋼瓶的正確使用：鋼瓶氣由氣體廠提供，其純度可分為普級(jí)和高純級(jí)。前者純度為99.9%以上，后者純度為99.99%以上。填充柱氣相色譜一般使用普級(jí)即可滿足要求，毛細(xì)管柱氣相色譜則最好用高純級(jí)氣體作載氣。氣瓶顏色：氫氣為綠底紅字，氮?dú)鉃楹诘S字，壓縮空氣為黑底白字。瓶上注明了純級(jí)。載氣純度不不符合要求，會(huì)使基線不穩(wěn)噪聲增大。（一）基本操作鋼瓶的瓶嘴上有一閥瓣開關(guān)。用8號(hào)扳手順時(shí)針方向旋轉(zhuǎn)為關(guān)閉，逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)為開啟，在瓶嘴上安裝減壓表才能開啟鋼瓶。2、減壓表的安裝與正確使用氣相色譜儀使用的各種氣體壓力為o.2~O.5MPa，因此需要通過減壓表使鋼瓶氣源的輸出壓力下降。減壓表一般分為氫氣表和氮?dú)獗?氧氣表)兩種。氮?dú)獗砜梢园惭b除了氫、乙快和其它燃?xì)馄恳酝獾母鞣N氣瓶上。兩種減壓表的區(qū)別是，氫氣表和氮?dú)怃撈渴欠纯勐菁y，逆時(shí)針方向旋緊，順時(shí)針方向松開;而氮?dú)獗砗偷獨(dú)馄孔旒捌渌麣怏w都是正扣螺紋。減壓表裝有兩個(gè)彈簧壓力表，分別指示鋼瓶內(nèi)和減壓后的氣體壓力。減壓后的氣體壓力可由T閥桿調(diào)節(jié)。順時(shí)針方向旋轉(zhuǎn)增加出口壓力，逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)則相反。

在每次開啟鋼瓶閥瓣之前應(yīng)先檢查T形閥桿是否處于放松(關(guān)閉出口)位置。如果T形閥桿處于開啟位置就開鋼瓶的閥瓣節(jié)門，則氣路系統(tǒng)的壓力驟增，容易損壞色譜儀中的閥門。3、氣路檢查氣相色譜儀的氣路要認(rèn)真仔細(xì)地進(jìn)行檢漏。氣路不密封將會(huì)在檢驗(yàn)過程中出現(xiàn)異?，F(xiàn)象，造成數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確。用氫氣作載氣時(shí)，氫氣若從柱接口漏進(jìn)柱恒溫箱，可能會(huì)發(fā)生爆炸事故。最常用的檢漏方法是皂膜檢漏法。皂膜檢漏法：即用毛筆蘸上中性皂液涂在各接頭處檢漏，檢畢用干布將皂液擦凈。

封閉系統(tǒng)壓力法檢漏對(duì)于安有轉(zhuǎn)子流量計(jì)的儀器，用封閉系統(tǒng)壓力法檢漏則更方便。將氮?dú)馔ㄈ霘饴废到y(tǒng)，觀察氣流是否通暢，然后關(guān)閉出口處，當(dāng)充人0.3~0.5MPa的氮?dú)夂?，轉(zhuǎn)子流量計(jì)的轉(zhuǎn)子若下降到底，則表明流量計(jì)以后的氣路不漏氣。這時(shí)再關(guān)閉氣體入口處，待氣壓平穩(wěn)后讀取柱前壓力，0.5h后再次讀取柱前壓力，若下降值不超過0.01MPa，則可認(rèn)為整個(gè)氣路不漏氣。（二）氣相色譜儀的操作氣相色譜分析所采用的檢測(cè)器不同，其操作程序有所不同，以具有氫火焰離子化檢測(cè)器（FID)色譜儀為例，介紹氣相色譜儀的操作。不同的生產(chǎn)廠商、不同型號(hào)的氣相色譜儀在操作步驟上也有差異，這里只作一般的介紹。1、開機(jī)前的準(zhǔn)備（1）首先安裝好色譜柱(不能接反)，并將色譜柱的末端經(jīng)連接管接入氫火焰離子化室（又稱離子頭）進(jìn)口部位。（2）檢查儀器各部分連接是否正確，檢查各穩(wěn)壓閥、針形閥及減壓表旋桿是否在關(guān)斷位置。（3）開啟載氣鋼瓶、調(diào)節(jié)減壓閥、穩(wěn)壓閥及針形閥，使柱前壓和載氣流速達(dá)到預(yù)定值。（4）進(jìn)行檢漏，當(dāng)?shù)獨(dú)?、氫氣、空氣都試漏完畢，關(guān)閉氫氣和空氣。只留開氮?dú)庾鬏d氣。2、開機(jī)和色譜條件的設(shè)置（1）打開儀器電源開關(guān)，使儀器通電(注意:儀器未接通載氣時(shí)，切不可通電，否則色譜柱和檢測(cè)器均可能被燒壞)。(2)進(jìn)行儀器的自檢，儀器則自動(dòng)判斷整個(gè)儀器系統(tǒng)中所有電子電路是否正常。（3）設(shè)置所需柱箱溫度、進(jìn)樣口溫度和檢測(cè)器溫度(FID檢測(cè)器的溫度應(yīng)高于110℃，否則點(diǎn)火后會(huì)造成檢測(cè)器內(nèi)積水而影響基線的穩(wěn)定性)，并開始升溫。3、點(diǎn)火和色譜測(cè)定（1）打開空氣、氫氣閥門，分別調(diào)節(jié)兩路氣體流量(由流量計(jì)顯示)為適當(dāng)值。操作中氣體流速一般控制的比例為:氮?dú)?氫氣:空氣=(1：1~l.5）:(10~15）。

(2)待檢測(cè)器溫度達(dá)到了設(shè)定溫度后，按動(dòng)點(diǎn)火鍵，若聽到爆鳴聲或用一光亮的冷金屬片放在FID檢測(cè)器排氣口上方，有冷凝水生成，則證明火巳點(diǎn)著。有時(shí)可能會(huì)點(diǎn)不著火，可加大氫氣流量。待點(diǎn)火后，再緩慢減小氫氣流量至正常值。(3)根據(jù)需要設(shè)置FID微電流放大器的靈敏度，并設(shè)置輸出信號(hào)衰減，調(diào)節(jié)“零點(diǎn)”電位器，使FID輸出信號(hào)在數(shù)據(jù)處理機(jī)或微機(jī)圖譜的零位附近。(4)點(diǎn)火后，待儀器穩(wěn)定0.5h，基線平穩(wěn)后，即可進(jìn)行色譜測(cè)定。進(jìn)樣后，若出現(xiàn)反峰，將儀器信號(hào)線兩個(gè)接頭對(duì)調(diào)即可4、色譜圖的分析判斷及色譜參數(shù)的調(diào)整（1）正常出峰后，可對(duì)微機(jī)的顯示屏或打出的色譜圖進(jìn)行觀察分析①各組分是否都流出了(這對(duì)用歸→化法進(jìn)行定量很重要)?②各組分流出時(shí)間是否太長?③各組分的峰分離情況如何?各組分的峰是否對(duì)稱?峰的大小是否合適？由此判斷色譜條件和色譜處理參數(shù)設(shè)置是否合理。(2)一般檢驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)中都給出了色譜分析條件和色譜處理參數(shù)這些均為典型的色譜條件和參數(shù)，可根據(jù)儀器的性能和色譜條件合適與否，主要看柱溫和載氣的流速。

5.定量分析操作(1）當(dāng)色譜條件和數(shù)據(jù)處理參數(shù)設(shè)置合理后，可進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)樣品的測(cè)定，并求出各組分的校正因子。(2)各組分的校正因子求出后，可進(jìn)行未知樣品的分析和測(cè)定。定量方法將在以后專門敘述。6.關(guān)機(jī)先將輸人氫氣和空氣的閥門關(guān)閉，以切斷FI的燃然后降低溫度。當(dāng)柱箱溫度低于80'C以下時(shí)，才能關(guān)閉載氣和電4426.關(guān)機(jī)先將輸入氫氣和空氣的閥門關(guān)閉，以切斷FID的燃?xì)夂椭細(xì)?，使火焰熄滅，然后降低溫度。?dāng)柱箱溫度低于80℃以下時(shí)，才能關(guān)閉載氣和電源開關(guān)。二、高效液相色譜法（HPLC)（高速液相色譜法、高壓液相色譜法）由經(jīng)典的液相層析法發(fā)展來的，始于1906年，比氣相色譜分析法早四十多年。但一度停滯，因其流動(dòng)相靠自身的重力流過色譜柱，效率低，分析周期長，缺乏自動(dòng)靈敏的檢測(cè)裝置。70年代后，又吸取氣相經(jīng)驗(yàn)迅速發(fā)展。高效液相色譜的特點(diǎn)：㈠應(yīng)用范圍廣只要能制成溶液的樣品都能分析，不受試樣揮發(fā)性的約束，對(duì)無法用氣相分離的沸點(diǎn)高，熱穩(wěn)定性差，分子量大的聚合物及離子形物質(zhì)，具有很大的適用性，都可用他來進(jìn)行分離，分析。㈡高壓供液壓力和進(jìn)樣壓力均很高，一般15～30mpa最高500mpa。㈢高速由于高壓，流動(dòng)相在色譜柱內(nèi)流速一般為1~10ml／分，個(gè)別達(dá)100ml／分以上。㈣高效柱效達(dá)5000塔板／m，而分離效能很高的G