1.1DNA重組技術(shù)的基本工具1基因工程的概念基因工程是指按照人們的愿望，進行嚴格的設(shè)計，通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。基因工程的別名基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)操作環(huán)境生物體外操作對象基因操作水平DNA分子水平基本過程剪切→拼接→導(dǎo)入→表達結(jié)果人類需要的基因產(chǎn)物23抗蟲害的玉米轉(zhuǎn)魚抗寒基因的番茄轉(zhuǎn)基因

鮭魚基因工程產(chǎn)品4轉(zhuǎn)黃瓜抗青枯病基因的甜椒乳汁中含有人生長激素的轉(zhuǎn)基因牛(阿根廷)5基礎(chǔ)理論和技術(shù)的發(fā)展催生了基因工程

DNA是遺傳物質(zhì)的證明DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)和中心法則的確立遺傳密碼的破譯基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn)工具酶的發(fā)明DNA合成和測序技術(shù)的發(fā)明DNA體外重組的實現(xiàn)重組DNA表達實驗的成功第一例轉(zhuǎn)基因動物問世PCR技術(shù)的發(fā)明基礎(chǔ)理論技術(shù)發(fā)明6DNA重組技術(shù)的基本工具

限制性核酸內(nèi)切酶——準確切割DNA的工具，即“分子手術(shù)刀”DNA連接酶——DNA片段的連接工具即“分子縫合針”

基因進入受體細胞的載體——基因轉(zhuǎn)移工具即“分子運輸車”7一、限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”分布：主要從原核生物中分離純化得到作用特點：特異性，即識別雙鏈DNA分子的

特定核苷酸序列，切割特定切點切點：每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的

磷酸二酯鍵種類：約4000種舉例：EcoRI限制酶能識別GAATTC序列，并在G和A之間切開結(jié)果：形成兩種末端黏性末端平末端8限制酶所識別的序列有什么特點

限制酶所識別的序列，無論是6個堿基還是4個堿基，都可以找到一條中心軸線，中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的。9限制性內(nèi)切酶限制酶101.什么叫黏性末端？當限制酶從識別序列的中心軸線兩側(cè)切開時，被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個伸出的核苷酸，他們之間正好互補配對，這樣的切口叫黏性末端。11

DNA被限制酶切斷后有兩個反向互補的“黏性末端”。被同一種限制切斷的幾個DNA具有相同的黏性末端，能夠通過互補進行配對。122.什么叫平末端？當限制酶從識別序列的中心軸線處切開時，切開的DNA兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫平末端。133.限制酶在原核生物中的作用

原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是，生物在長期的進化過程中形成了一套完善的防御機制，以防止外來病原物的侵害。限制酶就是細菌的一種防御性工具，當外源DNA侵入時，會利用限制酶將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，從而達到保護自身的目的。含有某種限制酶的細胞，其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識別切割序列，或者通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。14二、DNA連接酶——“分子縫合針”1.連接酶有兩種：一種是從大腸桿菌中分離得到的，稱之為E·coli連接酶。另一種是從T4噬菌體中分離得到，稱為T4連接酶。2.這兩種連接酶催化反應(yīng)基本相同，都是連接雙鏈DNA的缺口，而不能連接單鏈DNA。3.E·coli連接酶只能連接黏性末端；T4連接酶既可“縫合”黏性末端，又可“縫合”平末端。15DNA連接酶——“分子縫合針”DNA連接酶與DNA聚合酶一樣嗎？為什么？16答：不是一回事。（在相鄰核苷酸的3位碳原子上的羥基與5位碳原子上所連磷酸基團的羥基之間形成）（1）DNA聚合酶只能將單個核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羥基上，形成磷酸二酯鍵；而DNA連接酶是在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵。（2）DNA聚合酶是以一條DNA鏈為模板，將單個核苷酸通過磷酸二酯鍵形成一條與模板鏈互補的DNA鏈；而DNA連接酶是將DNA雙鏈上的兩個缺口同時連接起來。因此DNA連接酶不需要模板。此外，二者雖然都是由蛋白質(zhì)構(gòu)成的酶，但組成和性質(zhì)各不相同。17三、基因的載體——“分子運輸車”2.載體必須具備的條件：①能夠在宿主細胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存；②具有多個限制酶切點，以便與外源基因連接；③具有某些標記基因，便于進行篩選；（如抗菌素的抗性基因、產(chǎn)物具有顏色反應(yīng)的基因等）④對受體細胞無害。1.載體的作用：①將外源基因轉(zhuǎn)移到受體細胞中去。②利用運載體在受體細胞內(nèi)，對外源基因進行大量復(fù)制。3.常用的載體有：

質(zhì)粒，λ噬菌體的衍生物，動植物病毒等18質(zhì)粒質(zhì)粒是基因工程最常用的運載體，它廣泛地存在于細菌中，是細菌染色體外能夠自主復(fù)制的很小的環(huán)狀DNA分子，大小只有普通細菌擬核DNA的百分之一。要對天然質(zhì)粒進行人工改造19能復(fù)制并帶著插入的目的基因一起復(fù)制有切割位點有標記基因的存在，將來可用含青霉素的培養(yǎng)基鑒別。20練習(xí)1.在基因工程中，切割運載體和含有目的基因的DNA片段，需使用（）同種限制酶B.兩種限制酶同種連接酶D.兩種連接酶212.不屬于質(zhì)粒被選為基因運載體的理由是A、能復(fù)制（）B、有多個限制酶切點C、具有標記基因D、它是環(huán)狀DNAD練習(xí)223.基因工程是在DNA分子水平上進行設(shè)計施工的。在基因操作的基本步驟中，不進行堿基互補配對的步驟是（）A、人工合成目的基因B、目的基因與運載體結(jié)合C、將目的基因?qū)胧荏w細胞D、目的基因