添加菌劑對(duì)雞糞堆肥中四環(huán)素類抗生素、致病菌的影響,農(nóng)業(yè)基礎(chǔ)科學(xué)論文近年來(lái)，獸藥抗生素作為抗細(xì)菌性疾病和促生長(zhǎng)制劑，在集約化養(yǎng)殖中應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大，使用量逐年增加。據(jù)估計(jì)，我們國(guó)家每年抗生素原料生產(chǎn)量約21萬(wàn)t,華而不實(shí)有9.7萬(wàn)〔t46.1%〕的抗生素用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)，而四環(huán)素類抗生素在我們國(guó)家獸藥抗生素中生產(chǎn)和使用比例均為最大[1-2].而當(dāng)四環(huán)素類抗生素藥物隨飼料進(jìn)入動(dòng)物消化道后，只要少部分代謝反響生成無(wú)活性的產(chǎn)物，有30%~90%以原形通過(guò)糞便和尿液排出體外，對(duì)周圍環(huán)境和人體健康造成潛在的危害[3-4].四環(huán)素類抗生素是我們國(guó)家畜禽糞便中經(jīng)常檢出的抗生素類群，不同研究人員在北京、山東、上海、浙江、江蘇、吉林、陜西、寧夏等全國(guó)不同地域的畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)糞便中檢出四環(huán)素類[四環(huán)素〔Tetracycline,TC〕、土霉素〔Oxytetra-cycline,OTC〕和金霉素〔Chlortetracycline,CTC〕]殘留[5-7].當(dāng)前研究結(jié)果表示清楚，施用未處理糞便的土壤，土壤中抗性大腸菌群、抗性細(xì)菌和部分抗性基因的數(shù)量均有所升高，而對(duì)人和動(dòng)物致病菌的抗性有可能通過(guò)細(xì)菌間基因橫向轉(zhuǎn)移而獲得[8-11].好氧堆肥對(duì)糞便中四環(huán)素類抗生素殘留有較好的去除作用，而且不同的堆肥工藝對(duì)四環(huán)素去除也有影響。溫度、初始含水率、時(shí)間對(duì)豬糞中TC、OTC和CTC生物降解均有影響[12].翻堆+機(jī)械通風(fēng)能夠快速提高豬糞堆肥的堆體溫度，同時(shí)也能夠提高OTC、CTC等去除效果[13].添加微生物菌劑也能促進(jìn)四環(huán)素類抗生素的降解，BM菌劑〔一種芽孢桿菌生物復(fù)合制劑〕的添加能夠促進(jìn)四環(huán)素類抗生素〔TC、OTC、CTC〕降解[14];添加纖維素降解菌能夠提高雞糞堆肥中CTC和OTC的降解效果[15-17].當(dāng)前研究多考察實(shí)驗(yàn)室水平堆肥經(jīng)過(guò)中糞便的四環(huán)素類抗生素殘留降解，針對(duì)抗性細(xì)菌的研究較少。本研究通過(guò)四環(huán)素抗性細(xì)菌選擇性計(jì)數(shù)方式方法，綜合考察了實(shí)際堆肥生產(chǎn)情況下，添加菌劑對(duì)雞糞堆肥經(jīng)過(guò)中四環(huán)素類抗生素、致病菌及抗性細(xì)菌的影響。1材料與方式方法1.1堆肥原料及實(shí)驗(yàn)方式方法堆肥實(shí)驗(yàn)于2020年10月至2020年12月在北京市懷柔區(qū)寶山有機(jī)肥廠進(jìn)行。該廠以懷柔地區(qū)養(yǎng)雞場(chǎng)的雞糞為主要原料，并參加一定比例的羊糞或牛糞生產(chǎn)有機(jī)肥。本實(shí)驗(yàn)完全根據(jù)該廠的生產(chǎn)方式進(jìn)行。將12m3雞糞和6m3羊糞混勻后，平均分成兩堆，體積為3m2m1.5m.實(shí)驗(yàn)組〔CA〕接種自制菌劑〔接種量為0.3%〕，對(duì)照組〔CK〕不接種菌劑。待堆溫升至50℃后每隔1d翻堆一次，進(jìn)入二次腐熟期后停止翻堆。前25d為一次堆肥期，第25~50d為二次堆肥期，第50~110d是儲(chǔ)藏期。自制菌劑主要菌種為枯草芽孢桿菌〔Bacillussubtilis〕和地衣芽孢桿菌〔Baclicuslincheniformis〕，兩種發(fā)酵液按1∶1〔V∶V〕混合后，用草炭土進(jìn)行吸附。原料混合后的基本性質(zhì)見(jiàn)表1.1.2樣品采集及檢測(cè)方式方法在堆肥的第1、8、17、47〔二次堆肥〕、110d〔儲(chǔ)藏期〕，分3點(diǎn)取樣各500g后在勻質(zhì)袋中混合均勻，在24h內(nèi)檢測(cè)其總菌數(shù)及抗性細(xì)菌數(shù)，按四分法取樣100g于-80℃保藏用于抗生素檢測(cè)，剩余樣品風(fēng)干后檢測(cè)其他各項(xiàng)指標(biāo)。采用便攜式溫度計(jì)測(cè)定堆體溫度，每次選取堆體的不同位置和深度共5個(gè)點(diǎn)測(cè)定并取平均值。采用烘干法測(cè)定物料含水率。用蒸餾水按1∶10〔W∶V〕稀釋堆肥樣品，200rmin-1條件下，搖床振蕩混勻1h,然后8000rmin-1離心，取上清測(cè)定pH及電導(dǎo)率。有機(jī)質(zhì)、總氮、磷、鉀和總養(yǎng)分的檢測(cè)方式方法參照有機(jī)肥料標(biāo)準(zhǔn)NY525-2002.抗生素測(cè)定方式方法：取經(jīng)冷凍枯燥后的堆肥樣品0.5g,經(jīng)超聲萃取提取抗生素，通過(guò)固相萃取進(jìn)一步純化樣品，后經(jīng)超高壓液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀〔UPLC-MS/MS〕檢測(cè)[7].色譜柱ACQUITYUPLCBEHC18柱〔502.1mm,1.7m〕，柱溫40℃；樣品室溫度10℃；樣品進(jìn)樣體積5流動(dòng)相A為0.1%甲酸水，流動(dòng)相B為甲醇〔A∶B=90∶10〕，流速為0.35mLmin-1.質(zhì)譜條件〔表2〕：電噴霧電離離子源〔ESI〕；毛細(xì)管電壓ESI+3.5kV,ESI-3.0kV;氮?dú)饬髁?00Lh-1;霧化氣溫度400℃；離子源溫度150℃；錐孔氣流速30Lh-1;碰撞氣流速0.15mLmin-1;掃描形式為多反響監(jiān)測(cè)掃描形式〔Multireactionmonitor,MRM〕。在1g糞便樣品中添加100gkg-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)添加樣取4項(xiàng)目四環(huán)素TC/gkg-1土霉素OTC/gkg-1有機(jī)碳Org.C/%全氮TN/%全磷TP/%個(gè)平行，按上述方式方法，TC、OTC和CTC的加標(biāo)回收率分別為〔110.89.97〕、〔81.98.63〕、〔97.56.75〕gkg-1.微生物計(jì)數(shù)方式方法：參照GB20287-2006,取新鮮堆肥樣品10g參加100mL無(wú)菌水中，在旋轉(zhuǎn)式搖床上200rmin-1充分振蕩30min,靜置20min,用無(wú)菌移液器分別汲取5mL上述母液，參加45mL無(wú)菌水中，按1∶10進(jìn)行系列稀釋，每個(gè)樣品取3個(gè)連續(xù)的適宜稀釋度，汲取不同稀釋度的懸液0.1mL,參加對(duì)應(yīng)選擇培養(yǎng)基，并涂勻培養(yǎng)，每個(gè)梯度設(shè)兩個(gè)重復(fù)。總菌數(shù)〔TotalBacteriaCounts,TBC〕使用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)48h,大腸菌群采用伊紅美蘭瓊脂〔EMB〕37℃培養(yǎng)24h,沙門氏菌采用硫酸鉍瓊脂37℃培養(yǎng)24h,四環(huán)素抗性菌計(jì)數(shù)分別在對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基中添加終濃度為16mgL-1的TC[18].2結(jié)果與討論2.1菌劑添加對(duì)堆體溫度變化影響由于堆肥時(shí)間在秋冬季節(jié)，除起始5d外，環(huán)境溫度在10~15℃間小幅變動(dòng)，堆肥前期由于降雨影響，使堆肥升溫經(jīng)過(guò)有反復(fù)，實(shí)驗(yàn)組在10d內(nèi)溫度上升到60℃以上，并維持到第23d,第25d后進(jìn)入二次堆肥期，第47d后溫度降低到50℃下面〔圖1未顯示〕。在同樣的基質(zhì)及實(shí)驗(yàn)條件下，添加菌劑的實(shí)驗(yàn)組溫度整體高于對(duì)照組〔P0.05〕，且其高溫期溫度也明顯高于對(duì)照，講明0.3%的該型菌劑添加量能夠促進(jìn)堆肥升溫及提高實(shí)際堆肥溫度。2.2堆體理化性質(zhì)變化堆肥經(jīng)過(guò)中，物料理化性質(zhì)的變化如表3所示。肥料的含水率是考察堆肥腐熟程度的指標(biāo)之一，本實(shí)驗(yàn)中堆肥含水率隨著堆肥經(jīng)過(guò)的延長(zhǎng)而逐步下降。由于實(shí)驗(yàn)組堆體的溫度一直高于對(duì)照組，更有利于水份的蒸發(fā)，在整個(gè)高溫期含水率都略低于對(duì)照組。另一方面，由于家禽的消化道短，飼料中大量的蛋白質(zhì)會(huì)未經(jīng)充分的消化而排出體外，雞糞中蛋白質(zhì)較牛糞和豬糞要高，以雞糞為原料的堆肥經(jīng)過(guò)會(huì)在蛋白質(zhì)降解經(jīng)過(guò)中釋放氨，使堆體的pH升高。本實(shí)驗(yàn)中由于菌劑中含有蛋白降解功能的芽孢桿菌，使實(shí)驗(yàn)組的pH較對(duì)照組變化大〔5.86~8.66〕。細(xì)菌總數(shù)整體的變化趨勢(shì)是隨著溫度的持續(xù)升高逐步減小，至儲(chǔ)藏期后有緩慢的回升。2.3四環(huán)素類抗生素降解規(guī)律**堆肥起始階段，原料中含有四環(huán)素和土霉素兩種抗生素，均未檢測(cè)到金霉素。隨著堆肥溫度的升高和時(shí)間的延長(zhǎng)，兩種抗生素均呈現(xiàn)不同程度的降解〔圖2〕。四環(huán)素的降解在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的區(qū)別不大，都在17d后降解至檢測(cè)限下面。土霉素在實(shí)驗(yàn)組的堆肥中降解效果明顯，從起始的76gkg-1,經(jīng)過(guò)47d濃度降解至檢測(cè)限下面〔13.3gkg-1〕。這與OsmanArikan等[19]在牛糞中添加稻草等輔料堆肥效果相類似，表示清楚提高堆體溫度有利于土霉素的降解。而土霉素在對(duì)照組堆肥中降解效果并不明顯，至110d仍保持在70gkg-1左右，與原料中的初始濃度無(wú)顯著性差異〔P0.05〕。這與張樹(shù)清等[14]在雞糞堆肥中添加BM菌劑〔一種芽孢桿菌復(fù)合菌劑〕的效果類似，該研究也證實(shí)四環(huán)素的降解率大于土霉素，且添加菌劑堆體的降解率也高于對(duì)照組，講明堆肥菌劑的添加有利于四環(huán)素和土霉素的降解。2.4致病菌消減經(jīng)檢測(cè)可知，堆肥原料雞糞中含有沙門氏菌〔Salmonella〕和大腸菌群〔coliform〕，而且兩種病原菌中都含有一定比例的四環(huán)素抗性菌，原料雞糞中沙門氏菌為5.4lgCFUg-1,抗四環(huán)素沙門氏菌為4.52lgCFUg-1,占總沙門氏菌的16.7%〔圖3〕。大腸菌群數(shù)量為6.5lgCFUg-1,抗四環(huán)素的大腸菌群數(shù)量為6.16lgCFUg-1,占總大腸菌群的45.46%〔圖4〕，與CortneyMille等[20]檢測(cè)美國(guó)有機(jī)肥中大腸菌群結(jié)果近似〔1~6lgCFUg-1〕。沙門氏菌無(wú)論在對(duì)照組還是實(shí)驗(yàn)組，在堆肥第8d就檢測(cè)不出，而大腸菌群能持續(xù)檢出，直到二次堆肥末期〔第47d〕。隨著堆肥進(jìn)程，兩個(gè)堆體中四環(huán)素抗性的大腸菌群數(shù)量和相比照例均出現(xiàn)下降，講明堆肥高溫既能殺滅大腸菌群，也能消除四環(huán)素抗性的大腸菌群。2.5總菌數(shù)及四環(huán)素抗性細(xì)菌變化總菌數(shù)的變化如此圖5所示。堆肥初期，菌數(shù)隨著堆肥溫度升高而迅速減少，此時(shí)由于實(shí)驗(yàn)組添加菌劑使堆溫高于對(duì)照組，微生物減少速度也高于對(duì)照組，與熒光定量PCR計(jì)算的堆肥未培養(yǎng)細(xì)菌的絕對(duì)數(shù)量變化結(jié)果相類似[21].經(jīng)過(guò)二次堆肥后〔第47d〕，實(shí)驗(yàn)組菌數(shù)減少，而對(duì)照組菌數(shù)明顯增加，講明對(duì)照組中溫微生物利用高溫階段未降解的有機(jī)物迅速繁衍。在四環(huán)素抗性細(xì)菌方面，實(shí)驗(yàn)組中四環(huán)素抗性細(xì)菌出現(xiàn)先下降再緩慢上升的趨勢(shì)〔圖6〕，而對(duì)照組四環(huán)素抗性細(xì)菌一直處于下降趨勢(shì)，兩者原料和成品肥料間的抗性細(xì)菌數(shù)量總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)〔圖7〕，分別相差1.41lgCFUg-1〔實(shí)驗(yàn)組〕和1.608lgCFUg-1〔對(duì)照四環(huán)素抗性沙門氏組〕，而抗性菌所占比例分別為4.00%〔實(shí)驗(yàn)組〕和1.17%〔對(duì)照組〕，均高于原料的0.40%〔實(shí)驗(yàn)組〕和0.39%〔對(duì)照組〕。固然升溫有利于抗生素的消減，但含有四環(huán)素抗性細(xì)菌對(duì)高溫具有更好的耐受性，進(jìn)而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)組第19c1時(shí)四環(huán)素抗性菌的比例得到明顯提高〔〔1.3%至9.6%〕，而高溫期過(guò)后，四環(huán)素抗性細(xì)菌競(jìng)爭(zhēng)不過(guò)沒(méi)有抗性質(zhì)粒的細(xì)菌，所以固然抗性細(xì)菌的數(shù)量得到回升，但所占比例大幅下降〔〔4.0%〕。四環(huán)素抗性細(xì)菌的這種先升高再降低的現(xiàn)象，與Selvam等，研究堆肥中四環(huán)素抗性基因變化規(guī)律類似。以上結(jié)果講明，堆肥成品與初始原料相比，華而不實(shí)的四環(huán)素抗性細(xì)菌比例呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，與廢水處理中出水與進(jìn)水的四環(huán)素抗性細(xì)菌比例變化情況相類似}is畜禽養(yǎng)殖糞便堆肥化處理有利于消減養(yǎng)殖業(yè)對(duì)環(huán)境的抗生素污染，而四環(huán)素抗性基因在堆肥中變化規(guī)律有待進(jìn)一步研究，并且由于有機(jī)肥最終由農(nóng)田、果園等土壤所消納，所以有必要進(jìn)一步研究四環(huán)素抗性細(xì)菌及其抗性基因在種植經(jīng)過(guò)中的遷移規(guī)律。3結(jié)論C1〕菌劑的添加有利于堆肥升溫，并且能夠提高土霉素在堆肥中的降解效率、〔2〕經(jīng)過(guò)二次堆肥能夠有效殺滅致病菌〔沙門氏菌和大腸菌群，并且能夠消減四環(huán)素抗性的致病菌C3〕堆肥處理能夠有效消減四環(huán)素抗性菌的絕對(duì)數(shù)量，添加菌劑可能導(dǎo)致后期抗性細(xì)菌數(shù)量的增長(zhǎng)〔4〕堆肥經(jīng)過(guò)中，抗性細(xì)菌比例呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，堆肥成品中的四環(huán)素抗性菌比例高于原料.以下為參考文獻(xiàn)：[1]王云鵬，馬越。養(yǎng)殖業(yè)抗生素的使用及其潛在危害[J].中國(guó)抗生素雜志，2008,33〔9〕：519-522.WANGYun-peng,MAYue.Potentialpublichazardofusingantibioticsinlivestockindustry[J].ChineseJournalofAntibiotics,2008,33〔9〕：519-522.[2]王瑞，魏源送。畜禽糞便中殘留四環(huán)素類抗生素和重金屬的污染特征及其控制[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2020,32〔9〕：1705-1719.WANGRui,WEIYuan-song.Pollutionandcontroloftetracyclinesandheavymetalsresiduesinanimalmanure[J].JournalofAgro-Environ-mentScience,2020,32〔9〕：1705-1719.[3]SarmahA,MeyerM,BoxallB.Aglobalperspectiveontheuse,sales,exposurepathways,occurrence,fateandeffectsofveterin