《生物制藥》課程實驗大綱_文檔視界《生物制藥》課程實驗大綱

編號：

課程名稱：生物技術(shù)制藥

英文名稱：BiologicalPharmaceuticalTechnology

實驗指導(dǎo)書名稱：生物制藥實驗指導(dǎo)書

一、學(xué)時學(xué)分

總學(xué)時：32學(xué)分：2實驗學(xué)時：8

二、實驗?zāi)康?/p>

本課程實驗的目的是使學(xué)生掌握生物技術(shù)制藥中的基因工程制藥、抗體制藥、細(xì)胞工程制藥、酶工程制藥、微生物工程制藥的基本原理、主要方法和技術(shù)，從而使學(xué)生能夠?qū)⒗硇灾R與感性認(rèn)識有機(jī)地結(jié)合起來，在實驗中更深地理解基礎(chǔ)理論，提高學(xué)生的綜合能力與創(chuàng)新意識以及分析問題和解決問題的能力。同時通過實驗，培養(yǎng)學(xué)生觀察、思考、分析問題和解決問題的能力，實事求是，嚴(yán)肅認(rèn)真的科學(xué)態(tài)度，以及勤儉節(jié)約、愛護(hù)公物的良好作風(fēng)。

三、實驗基本原理

純培養(yǎng)技術(shù)、無菌操作技術(shù)、分子生物學(xué)基本原理及技術(shù)、免疫學(xué)原理及技術(shù)、細(xì)胞工程原理及技術(shù)、蛋白質(zhì)工程原理。

四、實驗基本要求

在實驗內(nèi)容的安排上，注意使學(xué)生加深對生物制藥工藝基本理論的理解。實驗的難易程度適中，嚴(yán)謹(jǐn)全面。根據(jù)實驗指導(dǎo)書完成課內(nèi)實驗任務(wù)，客觀認(rèn)真填寫實驗數(shù)據(jù)并進(jìn)行結(jié)果分析、每次實驗及時上交實驗報告。

五、考核與報告

實驗考核以平時實驗預(yù)習(xí)報告、實驗態(tài)度、實驗操作及實驗處理幾部分組成，占

該門課程成績30％，實驗報告按實驗指導(dǎo)書提供的統(tǒng)一格式進(jìn)行書寫。

六、主要儀器設(shè)備

CO2培養(yǎng)箱、20W紫外燈、紅燈、血球記數(shù)板、攪拌器、高速冷凍離心機(jī)、冷凍干燥箱、真空干燥箱、高壓滅菌裝置、超凈工作臺、倒置顯微鏡、冰箱、液氮罐、精密天平、微量加樣器、烤箱、細(xì)菌過濾器、10L氣升式發(fā)酵罐、搖床、顯微鏡（帶油鏡）、紫外及可見光分光光度計、電泳儀、pH計等。

七、實驗項目與內(nèi)容提要

八、適用專業(yè)

生物技術(shù)

九、實驗地點

生物與食品工程學(xué)院實驗室

實驗一甲殼質(zhì)、殼聚糖的制備

【實驗?zāi)康摹?/p>

了解制備甲殼質(zhì)、殼聚糖的工藝流程；

掌握甲殼質(zhì)的提取、制備原理及殼聚糖的檢測方法。

【實驗原理】

甲殼質(zhì)存在于甲殼類動物(如蝦、蟹)的外殼，昆蟲表皮，軟體動物(如貝類、烏賊)的器官、菌類(如菇類、霉菌)的細(xì)胞壁。自然界每年合成量高達(dá)100億噸，僅次于植物纖維素。甲殼質(zhì)是1823年法國科學(xué)家Odier首次從蟹殼中提取出來的，由于甲殼質(zhì)的性質(zhì)非常穩(wěn)定，溶解性很差，限制了它的應(yīng)用。經(jīng)一個多世紀(jì)世界各地科學(xué)家對它在結(jié)構(gòu)上進(jìn)行改良、修飾，并開發(fā)應(yīng)用研究，它的衍生物殼聚糖在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、畜產(chǎn)、漁業(yè)、食品、化妝品及醫(yī)藥行業(yè)上得到廣泛應(yīng)用，尤其是近十多年來，殼聚糖的動物試驗及臨床觀察得到科學(xué)家們的肯定，譽為人類第六生活要素(蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、礦物質(zhì)和殼聚糖)。是一種功能性食品。

從蝦殼提取甲殼質(zhì)，工藝主要是將蝦殼的成份分離，蝦殼中含有無機(jī)鹽(主要為碳酸鈣)蛋白質(zhì)和甲殼質(zhì)。利用碳酸鈣能溶于鹽酸的機(jī)理，將其離析。蛋白質(zhì)在堿性條件下能被水解生成短肽及氨基酸，它們能溶于水，與甲殼質(zhì)分離。本實驗首先采用鹽酸浸泡蝦殼除去鈣質(zhì)，接著利用氫氧化鈉煮沸除去蛋白，之后水洗；用高錳酸鉀與硝酸氧化脫色干燥得白色制品為甲殼質(zhì)。

甲殼質(zhì)在堿性條件下脫去乙?；删郯诽?。工業(yè)上很難100％脫去乙酰基，所以工業(yè)制得的實際上是甲殼質(zhì)和聚葡胺糖兩個結(jié)構(gòu)單元的結(jié)合，稱為殼聚糖。殼聚糖結(jié)構(gòu)中有胺基(－NH2)，具堿性，因此，它能溶于很多酸，如硫酸、鹽酸、胃酸等，可以用游離氨基含量的來檢測乙?；拿撊コ潭取?/p>

【儀器、材料與試劑】

1實驗材料與試劑

蝦殼；

3％~4%的氫氧化鈉；50％的氫氧化鈉；5％~6%的鹽酸；5%的高錳酸鉀；1%的硝酸；1mol/L的鹽酸；0.1mol/L的氫氧化鈉；溴酚蘭指示劑。

2儀器設(shè)備

燒杯1000mL；三角瓶500mL；三角瓶100mL；大試管夾；水浴鍋；烘箱；堿式滴定管；鐵架臺；磁力攪拌器；電爐等。

【實驗步驟】

1蝦殼處理：將蝦殼洗凈，粉碎，稱重。

2甲殼質(zhì)制備：

用5％~6%的鹽酸于室溫（20℃）浸泡蝦殼24小時，不斷攪拌。鹽酸體積（ml）

與蝦克重量（g）比為10（V/W=10）；

取沉淀水洗3次后加入3％~4%的氫氧化鈉（V/W=10）煮沸1~2小時，取沉淀水洗；

加0.5%的高錳酸鉀攪拌反應(yīng)約1小時，沉淀水洗;

再加入1%的硝酸于60℃~70℃反應(yīng)30~40分鐘，產(chǎn)物水洗、干燥、稱重。

3殼聚糖的制備：

于燒瓶中加入上述甲殼質(zhì)10克再加入90-100ml的濃度為10％的NaOH，沸水浴反應(yīng)30-40分鐘后，停止反應(yīng)干燥稱重。

4游離氨基含量的測定：

方法1：精確稱取殼聚糖0.30克，置于20ml的錐瓶中，移取30ml0.1mol/L的鹽酸溶液，室溫下溶解（若粘度太大可加少許蒸餾水）。加入2滴溴酚蘭指示劑，以0.1mol/L的氫氧化鈉溶液滴定至紫色，平行滴定三份，按下式計算游離氨基含量：

方法2：采用分光光度法檢測殼聚糖的含量，檢測殼聚糖的含量/純度（選做）?！窘Y(jié)果與分析】

計算甲殼質(zhì)的提取率和游離氨基含量并分析與理論值之間的差異。

【思考題】

甲殼質(zhì)的提取過程中用了哪些試劑，各起到了什么作用？

實驗二液體發(fā)酵法生產(chǎn)鏈霉素（選做）

【實驗?zāi)康摹?/p>

1、學(xué)習(xí)液體發(fā)酵的方法；

2、學(xué)習(xí)鏈霉素的發(fā)酵方法及抗生素的檢測和鑒定方法。

【實驗原理】

瓦克斯曼（SelmanA.Waksman）于1943年分離到一株灰色鏈霉菌（Streptomycesgriseus），能產(chǎn)生對革藍(lán)氏陽性細(xì)菌和藍(lán)氏陰性細(xì)菌都有抗菌作用的一種新的抗生素－鏈霉素。鏈霉素和其它抗生素一樣氏微生物的次級代謝產(chǎn)物。鏈霉素屬于氨基糖苷類抗生素。

灰色鏈霉菌在下述條件下產(chǎn)生鏈霉素。對細(xì)胞足夠的供氧；存在低濃度無機(jī)磷酸鹽；足夠的葡萄糖和足夠高濃度的含氮物質(zhì)。

在發(fā)酵培養(yǎng)基上，鏈霉素的發(fā)酵分3個階段：生長階段，菌絲形成，需氧量極大，在兩天內(nèi)形成鏈霉素不多；成熟階段，菌絲及重量保持穩(wěn)定，葡萄糖及其他碳源在培養(yǎng)基中消失，形成鏈霉素；老化階段，有許多鏈霉素形成，然后鏈霉素產(chǎn)生停止，濃度下降，pH上升，菌絲自溶，需氧量減少，此時停止發(fā)酵。

在中性溶液中，鏈霉素成為3價陽離子故可用陽離子交換樹脂吸附，然后進(jìn)行洗脫和收集。二次洗脫液要通過高交聯(lián)度的氫型樹脂，以除去陽離子、無機(jī)雜質(zhì)和小分子的有機(jī)雜質(zhì)。精制液用硫酸或氫氧化鋇調(diào)至pH4.5～5.0，再加入適量的活性碳，常溫下脫色，可得到鏈霉素精制液。

紙層析是鑒別抗生素的方法之一，常用8個溶劑系統(tǒng)進(jìn)行紙層析，層析后進(jìn)行生物顯色并繪制層析圖譜，根據(jù)層析圖譜對未知抗生素進(jìn)行鑒定。本實驗采用其中一個溶劑系統(tǒng)，并用標(biāo)準(zhǔn)鏈霉素溶液作為對照對發(fā)酵液進(jìn)行鑒定。

【儀器、材料與試劑】

（一）儀器

1、5L發(fā)酵罐

2、恒溫?fù)u床

3、冷凍離心機(jī)

4、高壓滅菌鍋等

（二）材料

1、灰色鏈霉菌StreptomycesgriseusAS4.1095（鏈霉素產(chǎn)生菌，中國菌種保藏中心）

2、大腸桿菌E.coliK12S（用于生物顯色）

3、金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus,用于生物顯色）

4、豌豆

5、正丁醇

6、三角瓶（50Ml）

7、新華3號濾紙

8、層析缸（30cm×10cm）

9、搪瓷盤（25cm×15cm×5cm）

10、毛細(xì)管

11、培養(yǎng)皿

（三）試劑

1、牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，瓊脂20g，水1000mL，pH7.4～7.6，121℃高壓蒸汽滅菌30min

2、豌豆培養(yǎng)基：葡萄糖10g，蛋白胨5g，豌豆提取液1L（以NH2計，100mL含12～14mg），pH7.0～7.2。高壓蒸汽滅菌（105℃，30min）

3、查氏培養(yǎng)基

4、鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液（10mg/mL）：將鏈霉素溶于去離子水中，無菌濾膜過濾后備用

5、展層溶劑系統(tǒng)：水飽和的正丁醇

【實驗步驟】

1、斜面孢子的制備

用接種環(huán)挑取冰箱中保藏的菌種接種于豌豆培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基上，于27℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～7d，即可得到斜面孢子。

2、母瓶培養(yǎng)液的制備

用接種環(huán)挑取斜面培養(yǎng)基表面上的孢子接種于滅菌的含有50mL豌豆培養(yǎng)基的三角瓶中，于27℃搖瓶200r/min培養(yǎng)72h即成母瓶培養(yǎng)液。

3、種子培養(yǎng)液的制備

無菌操作取2mL母瓶培養(yǎng)液接種于含有100mL豌豆培養(yǎng)基的三角瓶中，于27℃恒溫?fù)u床200r/min培養(yǎng)3～4d。

4、發(fā)酵培養(yǎng)

（1）三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)：

取4mL種子培養(yǎng)液接種于含有200mL豌豆培養(yǎng)基的500mL大三角瓶中，于28℃恒溫?fù)u床200r/min培養(yǎng)12～15d進(jìn)行鏈霉素發(fā)酵。

（2）發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)：

在5L發(fā)酵罐中裝入3L豌豆培養(yǎng)基，滅菌后接入60mL種子培養(yǎng)液，在控制條件下進(jìn)行鏈霉素發(fā)酵。

5、發(fā)酵液預(yù)處理

發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液在低溫條件下12000r/min離心，上清即為含有鏈霉素的樣品，如果不進(jìn)行鏈霉素的分離純化，可直接對發(fā)酵液進(jìn)行抗生素抑菌實驗和紙層析生

物顯色分析鑒定。

6、發(fā)酵液抑菌實驗

在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基平板上均勻涂布大腸桿菌或金黃色葡萄球菌，待其表面干燥后將小鋼管垂直置于平板表面，取發(fā)酵液0.1mL注入小鋼管中，于37℃恒溫培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。

7、鏈霉素的紙層析鑒定

（1）點樣：在距新華濾紙（25cm×19cm）底端2.5cm處劃一道橫線，用毛細(xì)管將發(fā)酵清液和標(biāo)準(zhǔn)鏈霉素溶液（10mg/mL）點在濾紙的橫線上。每個樣品之間距離2cm。（2）層析：將點好樣的濾紙做成圓筒狀，置于含有展層溶劑系統(tǒng)的層析缸中，于20～25℃上行擴(kuò)展20～25cm后取出，揮發(fā)除凈溶劑。

（3）顯影（生物顯影法）：將濾紙貼在接種有大腸桿菌或金黃色葡萄球菌的瓊脂平板上，置冰箱中(10℃，4h)，使濾紙上的抗生素滲透到平板上，然后于30～35℃培養(yǎng)16～20h，根據(jù)平板上樣品抑菌區(qū)的位置判斷抗生素的類型。

【結(jié)果與分析】

觀察鏈霉素發(fā)酵液對細(xì)菌的抑制作用及鏈霉素紙層析生物顯色圖譜。

發(fā)酵液離心上清抑菌結(jié)果，可觀察到明顯的抑菌圈，說明發(fā)酵液中含有抗菌物質(zhì)。發(fā)酵液和標(biāo)準(zhǔn)鏈霉素紙層析后經(jīng)生物顯色結(jié)果，可觀察到抑菌圈的位置在相同的位置，初步說明發(fā)酵液中的抗菌物質(zhì)為鏈霉素。

【實驗安排】

第一天：配制試劑、滅菌，接種斜面孢子

（斜面孢子的制備、母瓶培養(yǎng)液的制備、種子培養(yǎng)液的制備、發(fā)酵培養(yǎng)液的接種：在教師指導(dǎo)下由學(xué)生利用課余時間完成。全過程大約需要26～28d）。

第二天：發(fā)酵液預(yù)處理、發(fā)酵液抑菌實驗（24h后觀察記錄結(jié)果）和鏈霉素的紙層析及觀察記錄結(jié)果。

實驗三抗生素的分離和鑒別（薄層層析法）

【實驗?zāi)康摹?/p>

掌握薄層層析法分離抗生素的原理與方法；

了解生物顯影法在抗生素鑒定中的應(yīng)用。

【實驗原理】

薄層層析是一種微量而快速的層析方法。把吸附劑或支持劑均勻的涂布于玻璃板（或滌綸片基）上成一薄層，把要分析的樣品加到薄層上，然后用合適的展層劑進(jìn)行展開而達(dá)到分離、鑒定和定量的目的。

為了使要分析的樣品中的各組分得到分離，必須選擇合適的吸附劑。硅膠、氧化鋁和聚酰胺由于它們的吸附性能良好，是應(yīng)用最廣泛的吸附劑，硅藻土和纖維素則是分配層析中最常用的支持劑。在吸附劑或支持劑中添加合適的粘合劑后再涂布，可使薄層粘牢在玻璃板上。

在吸附層析中，雖用相同的吸附劑和溶劑系統(tǒng)，但不同性質(zhì)的抗生素由于其吸附能力的差異，比移植（Rf）也不同。因此，即使是性質(zhì)極為接近的同組抗生素的各個組分，在合適的溶劑系統(tǒng)中展開，也能達(dá)到分離的目的。

通過薄層色譜分離后的化合物經(jīng)生物顯跡確定斑點的位置后，可求得其Rf值，將該Rf與同一薄層上標(biāo)準(zhǔn)品的Rf作比較就可初步鑒別樣品中的抗生素。

【實驗用品】

（一）器材

1、硅膠GF254

2、玻璃板（100mm×200mm）

3、層析缸（20個）

4、測度盤（19.5cm×34cm的玻璃板筐）

5、微量注射器、濾紙、玻璃等

6、烘箱（2臺）、培養(yǎng)箱（2臺）、滅菌鍋（1臺）、超凈工作臺（1臺）

（二）試劑配制

1、展層溶劑系統(tǒng)：正丁醇：乙酸：水（3：1：1）

2、生物顯影用培養(yǎng)基：蛋白胨6g，酵母膏3g，牛肉膏1.5g，瓊脂20g，水1000mL，pH6.5（滅菌后）。

生物顯影時，測度盤內(nèi)培養(yǎng)基分上下兩層，上層培養(yǎng)基須另加0.5%的葡萄糖。3、生物顯影用枯草桿菌芽孢懸浮液將枯草桿菌（Bacillussubtilis1ATTC6633）接種在肉湯瓊脂大斜面培養(yǎng)基上（2支），37℃培養(yǎng)7d。用0.85％生理鹽水將枯草桿菌芽孢洗下，再用滅菌玻璃珠將芽孢分散，用0.85％生理鹽水稀釋成12×108/mL芽孢懸液。將此懸液于65℃水液中保溫30min，冷卻后保存于冰箱內(nèi)，可使用一個月。使

用前，最好先作抑菌試驗，以確定每100mL上層培養(yǎng)基需加入芽孢懸液的量。

（三）材料

枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisTATTC6633)；鏈霉素、卡那霉素等抗生素純品及粗制抗生素樣品若干種（鏈霉素或卡那霉素粗制品）。

【實驗步驟】

1、薄層的制備

制薄層用的玻板預(yù)先用洗液洗凈并烘干，玻板表面要求光滑。將硅膠GF254和雙蒸水（硅膠：雙蒸水＝10：25）于燒杯中攪拌均勻后用玻棒迅速涂布鋪平，輕輕振動玻板，使其分布均勻，鋪成厚度0.25mm的薄層板，在空氣中涼干（或在60℃烘箱中烘干）后移至110℃烘箱中活化1h，取出置干燥器中備用。

2、點樣

距薄板一端2cm處每隔2cm作一記號(用鉛筆輕輕點一下，切不可將薄層刺破)，用50uL微量注射器取抗生素純品或粗制品（分別溶于少量的甲醇中，濃度為0.5mg/mL）溶液在記號處點樣，點樣量為20uL。注意控制樣點擴(kuò)散直徑不超過3mm。

3、展開

將薄板點樣一端放入盛有展開劑的層析缸中（注意樣點不可直接與展開劑相接觸），展層至溶劑前沿距頂端1～2cm處時取出薄板，在溶劑前沿處作記號。空氣中涼干，除盡溶劑。

4、生物顯影

往測定盤內(nèi)倒入生物測定培養(yǎng)基150mL，放平。待凝固后再倒入60mL帶枯草桿菌的上層培養(yǎng)基，完全凝固后，將層析過的層析板（點樣的一面）直接貼在瓊脂表面，放置15min，取下層析板，將盤置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，約16h后取出觀察實驗結(jié)果。

5、結(jié)果處理

用筆描下抑制圈所在的位置和形狀，計算各抗生素樣品的Rf值。

【思考題】

1、薄層色譜的Rf值是鑒別化合物的主要參數(shù)，請指出再薄層色譜過程中影響化合物Rf值的主要因素有哪些？

2、假設(shè)某試樣的Rf值與標(biāo)準(zhǔn)品相同，請問能否據(jù)此確定該試樣與標(biāo)準(zhǔn)抗生素同質(zhì)？

實驗四植物細(xì)胞/組織培養(yǎng)（略）與細(xì)胞活性的鑒定

一、目的

練習(xí)以堿性染料中性紅和熒光染料（FDA，F(xiàn)M4-64）進(jìn)行活體染色的方法。通過活體染色及質(zhì)壁分離，進(jìn)行細(xì)胞死活的鑒定。

二、原理

用某種對植物無害的染料稀溶液對活細(xì)胞進(jìn)行染色稱活體染色。中性紅是常用的活體染料之一。在中性或微堿性環(huán)境下，植物的活細(xì)胞能大量吸收中性紅并向液泡排泄，液泡一般呈酸性，進(jìn)入液泡的中性紅解離出大量陽離子而呈櫻桃紅色,原