華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物過氧化物酶同工酶測(cè)定第1頁/共13頁2過氧化物酶是植物體內(nèi)常見的氧化酶，植物體內(nèi)許多生理代謝過程受其同工酶的種類及活性的調(diào)節(jié)。同工酶具有不同的遷移速度。將電泳后的凝膠置于含有H2O2及聯(lián)苯胺的溶液中染色，利用過氧化物酶催化H2O2分解并把聯(lián)苯胺氧化成藍(lán)色或棕褐色產(chǎn)物的原理，出現(xiàn)的藍(lán)色或棕褐色條帶即為過氧化物酶同工酶在凝膠中存在的位置，多條有色帶即構(gòu)成過氧化物酶同工酶酶譜。

第2頁/共13頁3二、材料、設(shè)備與試劑（一）實(shí)驗(yàn)材料：小麥芽。（二）設(shè)備：1.冷凍離心機(jī)；2.穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀；3.電泳槽（園盤型）等。（三）試劑

1.分離膠緩沖液2.分離膠貯液：

3.過硫酸銨：現(xiàn)配現(xiàn)用。第3頁/共13頁44.四甲基乙二胺(TEMED)。5.電極緩沖液：Tris6.0g，Gly（甘氨酸）28.8g，用水定容至1000mL(pH8.3)，用前稀釋10倍。

6.3%H2O2。7.聯(lián)苯胺染色母液：聯(lián)苯胺1g+冰醋酸18mL+H2O2mL溶解后貯于棕色瓶中。

8.同工酶染色液：配后立即使用。取0.5mL聯(lián)苯胺母液+9.3mLH2O+0.2mL3%H2O2。第4頁/共13頁5

三、實(shí)驗(yàn)步驟

（一）過氧化物酶的提?。ǘ╇娪静鄣陌惭b（三）分離膠的配制先準(zhǔn)備約6支干燥、潔凈的玻璃管，將下端用堵頭封閉，防于試管架上備用。按分離膠緩沖液∶分離膠貯液∶H2O∶過硫酸銨溶液=1.5mL∶3mL∶1.5mL∶6mL的比例吸取各溶液至小燒杯中，然后加入一滴四甲基乙二胺（TEMED），混合均勻，用尖嘴滴管灌吸取混合好的膠液并灌注到玻璃管中，直至膠液至玻管的刻度線處(如有氣泡應(yīng)設(shè)法排除)，然后沿玻管內(nèi)壁在膠面上緩慢加注0.5cm的水層，約30min左右，當(dāng)見到水層底下有一清楚界面時(shí)，表明膠已聚合。倒去水層，或用濾紙條吸干水分。（四）點(diǎn)樣（五）電泳

第5頁/共13頁6（六）剝膠

電泳完畢，將電泳槽取出，倒去緩沖液，取下凝膠管，放入培養(yǎng)皿中。用一個(gè)帶有長(zhǎng)針頭的注射器，吸滿水，將針頭沿管壁插入，同時(shí)慢慢地將注射器中的水推出，并不斷轉(zhuǎn)動(dòng)凝膠管，將凝膠管擠脫出來。

（七）染色

取0.5mL聯(lián)苯胺母液+9.3mLH2O+0.2mL3%H2O2，混勻后倒入盛有凝膠條的培養(yǎng)皿。此時(shí)可以看到膠條上出現(xiàn)藍(lán)色或棕褐色環(huán)，即過氧化物酶酶帶，約10min后用自來水沖洗，此時(shí)藍(lán)色帶會(huì)慢慢變?yōu)樽睾稚珬l帶。第6頁/共13頁7四、結(jié)果用尺子量出各酶帶和溴酚藍(lán)的遷移距離，計(jì)算各同工酶的遷移率，并劃出同工酶圖譜。第7頁/共13頁第8頁/共13頁第9頁/共13頁28S18S