ICS120.10天津市地DB12方標(biāo)準(zhǔn)DB12/T527—2014奶牛結(jié)核病凈化技術(shù)規(guī)范ThetechnicalstandardforcleaningofBovineTuberculosisindairycattle天津市市場(chǎng)和質(zhì)量監(jiān)督管理委員會(huì)發(fā)布I前言GB/T1.1-2009的要求。的附錄A為資料性附錄。畜牧獸醫(yī)局提出。1術(shù)規(guī)范核病凈化的術(shù)語和定義、檢測(cè)方法、凈化措施、凈化群(場(chǎng))的認(rèn)定、凈化群 (場(chǎng))的維持。事奶牛飼養(yǎng)的單位和個(gè)人。范性引用文件GB48-2006病害動(dòng)物和病害動(dòng)物產(chǎn)品生物安全處理規(guī)程GBT18645-2002動(dòng)物結(jié)核病診斷技術(shù)術(shù)語和定義義適用于本文件。BovineTuberculosis(BTB)牛結(jié)核病(BovineTuberculosis,BTB)是由牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)引起的一種人獸共leaninglergyReaction2傷細(xì)胞、自然殺傷T細(xì)胞、CD4Th1和CD8T淋巴細(xì)胞、效應(yīng)T細(xì)胞)分泌的促炎性細(xì)胞因子。4檢測(cè)方法4.1牛型結(jié)核分枝桿菌PPD(提純蛋白衍生物)皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)(即牛提純結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn))按GB/T18645-2002規(guī)定操作。4.2γ-干擾素ELISA試驗(yàn)作為牛型結(jié)核分枝桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)的補(bǔ)充試驗(yàn)(見附錄A)。凈化措施成年牛每年春秋兩季各進(jìn)行一次檢測(cè)。5.1.2對(duì)奶牛群(場(chǎng))存欄奶牛按100%比例進(jìn)行檢測(cè)。連續(xù)兩次檢測(cè)均為陰性者視為陰性牛。5.2隔離牛型結(jié)核分枝桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)和γ-干擾素反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果陽性或可疑牛須與受威脅的陽性牛的處理1撲殺對(duì)確認(rèn)的結(jié)核病陽性牛全部撲殺。消毒液5.5引種3人員6凈化群(場(chǎng))的認(rèn)定為陰性。7凈化群(場(chǎng))的維持7.1達(dá)到凈化標(biāo)準(zhǔn)的奶牛群(場(chǎng))每年進(jìn)行檢測(cè)。牛進(jìn)行檢疫。消毒。理工作。4 (資料性附錄)γ-干擾素ELISA試驗(yàn)A.1試驗(yàn)材料A.1.1牛結(jié)核分枝桿菌γ-干擾素ELISA試劑盒(內(nèi)含酶標(biāo)板、牛γ-干擾素陽性對(duì)照、牛γ-干擾素陰沖液、100倍濃縮的顯色劑溶液和終止液)A.1.2牛型提純結(jié)核菌素(牛型PPD)禽型提純結(jié)核菌素(禽型PPD)空管養(yǎng)板單道可調(diào)移液器及配套吸頭(20μL-200μL、100μL-1000μL、1mL-10mL)道移液器及配套吸頭(50μL-300μL)量筒(100mL、1L、2L)有蓋離心管(1.5mL)A.2試劑配制A。A濃縮的酶標(biāo)結(jié)合物稀釋液。A2.6洗液用去離子水或蒸餾水重新溶解20倍濃縮的洗液。A2.7顯色劑溶液將100倍濃縮的顯色劑溶液用底物緩沖液做100倍稀釋配制。A.3試驗(yàn)方法A.3.1臨床樣本采集及預(yù)處理A全血的運(yùn)送肝素鈉抗凝全血應(yīng)在周圍環(huán)境溫度(22±5)℃運(yùn)送，并且最好在采血后8h(最長(zhǎng)不超過30h)內(nèi)用于檢測(cè)。A孔組A.3.1.4加入牛型PPD、禽型PPD和PBS向24孔培養(yǎng)板中每份樣品對(duì)應(yīng)的3個(gè)孔分別無菌加入100μLA.3.1.5全血孵育過夜將全血培養(yǎng)板置CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，37℃孵育18h(全血可接受培養(yǎng)時(shí)間為16~524h)。AhL.5mL離A.3.2檢測(cè)方法A.3.2.2向酶標(biāo)板中的96孔中分別加入50μL血漿稀釋緩沖液，再向相應(yīng)孔中加入50μL待測(cè)樣品和±5)℃]孵育[(60±5)min]。用洗板機(jī)洗滌6次，將酶標(biāo)板放在干凈的濾紙上拍打幾次，盡量除AL(60±5min)，洗滌6次。AμL新鮮配制的顯色劑溶液，充分振蕩混合。室溫避光孵育30min。AminODOD值計(jì)算結(jié)果。A.3.3結(jié)果判定AOD照重復(fù)孔OD450值差≤0.04；牛γ-干擾素陽性對(duì)照OD450值>0.7。A.3.3.2計(jì)算每頭動(dòng)物所有樣品(包括加入牛型PPD、禽型PPD和PBS)的OD450值陽性=牛型PPD的