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文檔簡介

實(shí)驗(yàn)三枯草芽孢桿菌堿性磷酸酶的鹽析與分析第1頁/共10頁實(shí)驗(yàn)?zāi)康膹目莶菅挎邨U菌中分離提取堿性磷酸酶進(jìn)行酶活分析第2頁/共10頁實(shí)驗(yàn)原理堿性磷酸單酯酶（EC:3.1.3.1）又稱堿性磷酸酯酶，堿性磷酸酶，官方英文名為Alkalinephosphatase

堿性磷酸單酯酶廣泛分布于原核及真核生物各組織中，一般存在于外周胞質(zhì)中。其用途一般有：1）在用32P標(biāo)記5’末端前，去除DNA或RNA的5’磷酸。2）去除DNA片段5’磷酸以防止質(zhì)粒DNA連接和自身環(huán)化。

最適溫度37℃，最適pH10，對底物只具有相對的專一性，在堿性條件下水解磷酸酯：

單磷酸酯＋水醇＋磷酸

第3頁/共10頁高濃度鹽

溶液處理

MgCl2破壁

抽提透析處理純化硫酸銨處理鹽析除雜蛋白第4頁/共10頁鹽析根據(jù)不同的蛋白質(zhì)在同一濃度鹽溶液中的溶解度不同而利用不同濃度的鹽溶液使每個(gè)蛋白質(zhì)成分分別析出的方法稱為蛋白質(zhì)的鹽析。第5頁/共10頁實(shí)驗(yàn)材料枯草桿菌發(fā)酵液Tris－HCl緩沖液（pH7.4、9.5）1mol/LMgCl2

溶液40mmol/L對硝基酚磷酸（NPP）溶液第6頁/共10頁實(shí)驗(yàn)步驟細(xì)胞培養(yǎng)與收集

每組取約50mL枯草桿菌發(fā)酵液8000rpm離心5min，收集菌體棄去上清。用pH7.4的Tris－HCl緩沖液洗滌菌體一次并棄去上清。堿性磷酸酶的提取

得到菌體沉淀后，每管加入5mLpH7.4的Tris－HCl緩沖液，使細(xì)胞重懸。然后再加入1mL1mol/LMgCl2

溶液，于室溫振蕩10min；8000rpm離心5min，取上清液即為粗酶液。取樣測酶活。第7頁/共10頁硫酸氨鹽析

將上述粗酶液，緩慢加入硫酸銨粉末，使之達(dá)到50％飽和度（313g/L），12000rpm離心5min，去除雜蛋白沉淀。

取上清液，再加固體硫酸銨，使之濃度分別達(dá)到70、75、80、85、90％充分溶解后，12000rpm離心5min。得到粗酶沉淀。

透析處理

沉淀用2mLpH7.4的Tris－HCl緩沖液溶解，裝進(jìn)透析袋，在室溫下透析1周。取樣測定純品酶活。第8頁/共10頁酶活測定溶液加量pH9.5Tris－HCl緩沖液750μLNPP250μL樣品0.5ML37℃保溫10min0.5mL0.5MNaOH

終止反應(yīng)稀釋至10mL酶活力單位：在420nm波長

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