實(shí)驗(yàn)五轉(zhuǎn)基因植物的檢測第1頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四1、檢測外源基因在植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄，對外源基因表達(dá)調(diào)控進(jìn)行研究，掌握引物的選擇、cDNA的合成、RT-PCR檢測的原理與方法。。實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡?頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四第3頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四第4頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四第5頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四第6頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四第7頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四第8頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四第9頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四第10頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四第11頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四第12頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四第13頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四第14頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四第15頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四1、材料：轉(zhuǎn)基因植物的RNA或mRNA制備物。非轉(zhuǎn)化的植株材料總RNA或mRNA制備物2、設(shè)備：PCR儀、移液器、PCR管等。3、試劑：10×RT緩沖液、dNTP、逆轉(zhuǎn)錄酶、引物（隨機(jī)引物，OligodT;特異引物)、10×OneStepRNAPCRBuffer、25mMMgCl2、10mMdNTP、RNaseInhibitor(40U/μl)、AMV-OptimizedTaq1μl、AMVRTaseXL(5U/μl)、上游特異Primer(20μM)*1、下游特異Primer(20μM)*2、RNaseFreeH2O。實(shí)驗(yàn)材料、設(shè)備及試劑第16頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四實(shí)驗(yàn)操作步驟：1）RNA提?。?/p>

關(guān)鍵防止RNA降解RNA提取的成功與否是RT-PCR檢測中最重要的步驟。第17頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四2、cDNA第一鏈的合成：取1個(gè)0.2ml的PCR管，依次加入下列試劑：10×PCRBuffer1μlRNaseFreedH2O5.75μldNTP1μlRNaseInhibitor0.25μlAMVRTaseTranscriptase0.5μloligodT-Adaptorprimer0.5μlRNA1μlTotal10μl實(shí)驗(yàn)步驟第18頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四反應(yīng)條件：

42℃30min99℃5min5℃5min第19頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四3、PCR反應(yīng)取一個(gè)0.2ml的PCR管，依次加入下列試劑：

10×PCRBuffer

4μl

滅菌蒸餾水9μl

10mMdNTP２.5μl

Taq酶0.1μl

上游特異Primer(20μM)*1

0.2μl

下游特異Primer(20μM)*2

0.2μl

Total16μl

將（1）的反應(yīng)結(jié)果稀釋20倍，取10μl加入到（2）管中，輕輕搖勻。第20頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四反應(yīng)條件：94℃2min94℃30s55℃30s72℃1min72℃7min30Cycles第21頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四目前研究轉(zhuǎn)基因植物外源基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的常用方法1、RT-PCR(RNA)

2、Northernblot(RNA)

3、real-timePCR(RNA

）

第22頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四結(jié)果與分析利用凝膠成像分析儀對電泳結(jié)果進(jìn)行拍照和結(jié)果記錄；觀察膠上是否有預(yù)擴(kuò)增的主要產(chǎn)物帶。對比目的基因產(chǎn)物的電泳譜帶分子量和譜帶的特異性，確定和描述譜帶特征。

RT-PCR擴(kuò)增得到的810bp的目的基因產(chǎn)物的電泳結(jié)果第23頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四1、將實(shí)驗(yàn)結(jié)果粘到實(shí)驗(yàn)報(bào)告上。2、如何選擇RT-PCR的反轉(zhuǎn)錄引物。3、結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，試論應(yīng)用RT-PCR研究外源基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的優(yōu)缺點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)報(bào)告第24頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四實(shí)驗(yàn)一、質(zhì)粒三種提取方法的比較為什么要用對數(shù)期的菌液提取質(zhì)粒？因?yàn)閷?shù)期菌的生長狀況和數(shù)量最佳,有利于提取質(zhì)粒

溶液Ⅱ、溶液Ⅲ的作用？溶液Ⅰ50mM葡萄糖/10mMEDTA/25mMTris-HCl，pH=8.0葡萄糖增稠，使懸浮后的大腸桿菌不會(huì)快速沉積到管子的底部；EDTA抑制DNase的活性。這一步溶液中還可以加入RNase，不受EDTA影響，并且可以在后續(xù)步驟中被除去溶液Ⅱ0.2MNaOH/1%SDS破細(xì)胞的主要是堿，而不是SDS，所以才叫堿法抽提。溶液Ⅲ3M醋酸鉀/2M醋酸這一步的K置換了SDS（十二烷基磺酸鈉）中的Na，得到PDS（十二烷基磺酸鉀）沉淀；SDS易與蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個(gè)氨基酸上結(jié)合一個(gè)SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)也沉淀了，同時(shí)基因組DNA也被PDS共沉淀第25頁，共26頁，