Q&A關(guān)于噬菌體污染處理：

1、環(huán)境用漂白粉滅菌；2、用消毒液浸泡相關(guān)器具；

3、菌種室甲醛熏消一夜；4、福爾馬林溶液浸泡；5、更換或交替使用發(fā)酵劑；6、采用抗性菌株；特征：

1、培養(yǎng)液變澄清；

2、養(yǎng)份沒有被正常消耗；3、噬菌斑：菌液涂板后出現(xiàn)溶菌透明圈，即噬菌斑；污染原因：菌體自帶噬菌體(特別是溶源性細(xì)菌);

環(huán)境中存在；表達(dá)產(chǎn)物AKP蛋白的檢測(cè)

基因的克隆與表達(dá)專題之八AKP,大腸桿菌堿性磷酸酶

(大腸桿菌堿性磷酸酯酶，EC.3.1.3.1)在堿性環(huán)境下:

水解多種磷酸單酯化合物需要鎂和錳離子為激活劑關(guān)于AKP(E.colialkalinephosphatase）蛋白檢測(cè)指標(biāo)1、質(zhì)活性分子量定性結(jié)構(gòu)2、量表達(dá)產(chǎn)率獲得產(chǎn)量蛋白濃度純度根據(jù)蛋白的特性Western，測(cè)序等電泳，分子篩，沉降系數(shù)等光/色譜，晶體衍射等分光，凱氏定氮等電泳，沉降、晶體衍射等1、酶活測(cè)定：底物顯色法AKP405nm有特征吸收本實(shí)驗(yàn)410nm測(cè)定OD值pNPP（對(duì)硝基酚磷酸）無色＋PipNP（對(duì)硝基酚）黃色Na3PO4比爾-朗伯定律：ODλ=?LCεpNP=17500L·mol-1

·cm-1

C:光吸收物質(zhì)的濃度（mol·L-1）L:光路長度（cm）1、酶活測(cè)定：底物顯色法（其中n為稀釋倍數(shù)）酶活力單位數(shù)＝

注:通過調(diào)整稀釋倍數(shù)控制OD410在0.1～0.8之間30℃反應(yīng)10min加入3.6ml終止液終止反應(yīng)于410nm處測(cè)定吸光值40μL酶液360μL測(cè)活液+1.菌體加入15mL勻漿液2.超聲破碎：輸出功率1200w，超聲2秒，間隔10秒，超聲次數(shù)：40次3.粗勻漿制樣：細(xì)胞破碎液200uL＋4x樣品處理液100uL+勻漿緩沖液100uL

90℃變性5min，室溫保存準(zhǔn)備SDS電泳用。

取1ml粗勻漿置于冰上，準(zhǔn)備測(cè)活4.勻漿上清制備：

另取1.0mL細(xì)胞破碎液，4℃,12000rpm×10min離心，留上清液5.上清液制樣：

勻漿上清200uL＋4x樣品處理液100uL+勻漿緩沖液100uL，

90℃變性5min，室溫保存準(zhǔn)備SDS電泳用。余下的上清置于冰上，準(zhǔn)備測(cè)活一、細(xì)胞破碎與制樣組別空白

零對(duì)照空載體表達(dá)陰性對(duì)照

(藍(lán)斑)pETBlue-AKP

陽性對(duì)照AKP表達(dá)粗勻漿上清粗勻漿上清勻漿液（uL）4000000粗勻漿（uL）040400400離心上清（uL）00040040測(cè)活液（uL）360360360360360360室溫反應(yīng)10min終止液（mL）3.63.63.63.63.63.6OD410酶的活力二、AKP酶活性分析謝謝！SDS的濃縮效應(yīng)電泳體系為不連續(xù)體系電泳緩沖液與凝膠中的緩沖液不同凝膠也由PH、凝膠孔徑均不相同的兩層膠組成Cl－的快速泳動(dòng)在其后面形成低電導(dǎo)，高電壓梯度區(qū)帶動(dòng)Pr－和Gly－快速泳動(dòng)，這樣在高電壓與低電壓區(qū)形成界面，Pr濃縮成狹小薄層電荷效應(yīng)、凝膠的分子篩效應(yīng)－＋Tris-GlypH8.3Tris-GlypH8.3濃縮膠pH6.8分離膠pH8.8Gly－、

Pr－、Cl－樣品濃縮后的樣品SDS的變性作用SDS在溶液中能破壞蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的非共價(jià)鍵β－巰基乙醇或二硫蘇糖醇（DTT)的作用使蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵打開∴二者的作用使蛋白質(zhì)變成單亞基并結(jié)合上SDS形成蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物由于SDS帶有大量的負(fù)電荷，掩蓋了蛋白質(zhì)原有的電荷SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合，改變了蛋白質(zhì)原有的構(gòu)象，變成了近似于長橢圓棒，其短軸長度一樣，而長軸與分子量大小成正比∴SDS中，SDS－蛋白復(fù)合物的遷移率不再受蛋白的電荷和形狀的影響，而只與蛋白質(zhì)的分子量正相關(guān)空載體離心后離心前MKd97664536141.洗凈膠板，架好和固定好膠板

2.配置12%分離膠（20mL）

3.分離膠混勻后用5mL槍頭加入兩玻

璃夾縫中，并小心在膠面上加入

1cm蒸餾水，約20－40min后膠自然凝聚

4.傾斜倒出蒸餾水，配制5%濃縮膠（10mL）

5.濃縮膠混勻后加入兩玻璃夾縫

6.在兩玻璃板夾縫中垂直插入1.5mm的梳子，濃縮膠凝固后將凝膠裝

入電泳槽，在槽中加入1×SDS電極緩沖溶液，小心拔出梳子三、AKP的SDS－PAGE電泳7.電泳加樣：將樣品12,000r/min室溫離心10min后，

按順序向膠孔中加入適當(dāng)體積的蛋白樣品（20－30uL）和標(biāo)準(zhǔn)樣品（10uL）8.電泳：接通電源，電壓設(shè)定為80V開始電泳，當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠時(shí)，調(diào)節(jié)電壓使其恒定在120V,當(dāng)溴酚藍(lán)移動(dòng)到離底部時(shí)，切斷電源，停止電泳9.將膠板從電泳槽中取出，小心從玻璃板上取下凝膠，將凝膠切成兩部分10.含蛋白標(biāo)準(zhǔn)的凝膠部分用R250染色、脫色和觀察結(jié)果謝謝！實(shí)驗(yàn)操作1.另一部分凝膠、濾紙和硝酸纖維素膜分別在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡至少30分鐘2.正極上鋪三層和凝膠一樣大小的濾紙，然后依次將硝酸纖維素（NC）膜和凝膠鋪在濾紙上，再在凝膠上鋪三層濾紙，吸干“三明治”樣結(jié)構(gòu)周圍的印跡緩沖液，并壓另一極上（注意不要有氣泡）3.恒流1.0mA/cm2，電轉(zhuǎn)移1.5hr4.轉(zhuǎn)移結(jié)束后將NC膜取出，用保鮮膜封好，40C存放，凝膠繼續(xù)用R250染色以便分析轉(zhuǎn)移的完全程度四、免疫分析5.

到去封閉液，加入1xPBS稀釋的一抗（稀釋的倍數(shù)為ELISA所測(cè)效價(jià)的1/10），加入的一抗工作液覆蓋住膜即可