雙氧水預(yù)處理對(duì)氧化損傷的H9c2心肌細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制,生物化學(xué)論文心肌缺血再灌注損傷〔Myocardialischemiareperfusionin-jury，MIRI〕是指心肌缺血/缺氧一段時(shí)間，當(dāng)重新恢復(fù)血流或血氧供給后，心肌細(xì)胞功能代謝障礙及構(gòu)造毀壞反而較缺血/缺氧時(shí)進(jìn)一步加重、心功能進(jìn)一步惡化的病理生理經(jīng)過(guò)。細(xì)胞內(nèi)既有活性氧等氧化系統(tǒng)，也存在去除活性氧的抗氧化酶系統(tǒng)，如超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)等。在生理狀態(tài)下，體內(nèi)的氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，不會(huì)導(dǎo)致?lián)p傷。然而，缺血再灌注階段會(huì)產(chǎn)生大量活性氧，而機(jī)體又無(wú)法完全去除，這些過(guò)量的活性氧就會(huì)引起一些重要的生物大分子的氧化損傷，進(jìn)而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡和壞死。當(dāng)前以為活性氧介導(dǎo)的氧化損傷是引起心肌缺血再灌注損傷的重要原因。然而近年來(lái)大量研究表示清楚，H2O2預(yù)處理能保衛(wèi)PC12細(xì)胞抵抗氧化損傷，抑制氧化損傷導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。Guo等研究還發(fā)現(xiàn)活性氧可作為抗氧化酶第二信使激活級(jí)聯(lián)反響，增加SOD、CAT等抗氧化酶活性，去除活性氧，進(jìn)而起到抗氧化損傷的保衛(wèi)作用。對(duì)于氧化損傷的H9c2心肌細(xì)胞，當(dāng)前尚不清楚低濃度H2O2預(yù)處理能否具有保衛(wèi)作用以及能否上調(diào)抗氧化酶活性。本研究通過(guò)構(gòu)建大鼠H9c2心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，給予低濃度H2O2預(yù)處理，以討論低濃度H2O2預(yù)處理對(duì)氧化損傷的H9c2心肌細(xì)胞的保衛(wèi)作用及其機(jī)制。當(dāng)前，對(duì)于缺血再灌注損傷的防治尚無(wú)有效辦法，本研究在不改變損傷因子性質(zhì)的情況下，通過(guò)適宜濃度的活性氧進(jìn)行預(yù)處理，激活機(jī)體本身的抗氧化防護(hù)機(jī)制，進(jìn)而加強(qiáng)細(xì)胞對(duì)氧化損傷的抵抗能力，這種主動(dòng)性抵抗作用將為臨床防治缺血再灌注損傷提供了一種新的思路。1、材料與方式方法1.1材料大鼠心肌細(xì)胞系〔H9c2〕購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞中心。高糖DMEM為GIBCO公司產(chǎn)品，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司，胰蛋白酶、Hoechst33258購(gòu)自Sigma公司，CCK8試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天公司，超氧化物歧化酶〔SOD〕、丙二醛〔MDA〕試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品，An-nexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自?shī)W地利BenderMedSys-tems公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?.2實(shí)驗(yàn)方式方法和步驟1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和預(yù)處理方式方法將H9c2心肌細(xì)胞培養(yǎng)于含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。H2O2預(yù)處理按下面步驟施行：25mol/LH2O2作用90分鐘后，換為含15%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h，PBS漂洗2遍，然后給予2%FBS的高糖DMEM稀釋配置的400mol/LH2O2處理6h。1.2.2丙二醛〔MDA〕測(cè)定收集四組細(xì)胞，分別用200L的1%TritonX-100進(jìn)行充分裂解，15,000轉(zhuǎn)/分離心10min，收集上清，取100L上清，嚴(yán)格根據(jù)MDA試劑盒講明書(shū)操作，測(cè)定各管吸光度，根據(jù)公式計(jì)算得出各組MDA含量。1.2.3總超氧化物歧化酶〔T-SOD〕測(cè)定收集三組細(xì)胞，分別用200L的1%TritonX-100進(jìn)行充分裂解，15,000轉(zhuǎn)/分，離心10min，取50L上清，嚴(yán)格根據(jù)T-SOD試劑盒講明書(shū)操作，BCA法測(cè)定樣品蛋白濃度，酶標(biāo)儀檢測(cè)各組吸光度，根據(jù)公式計(jì)算出各組的SOD活性。1.2.4CCK8法檢測(cè)細(xì)胞存活率將H9c2心肌細(xì)胞按6104/ml接種于96孔板，每孔100L，細(xì)胞融合生長(zhǎng)至80%左右，實(shí)驗(yàn)分組要求處理各組細(xì)胞，每孔參加10L的CCK8液繼續(xù)培養(yǎng)2h，在酶標(biāo)儀450nm處，測(cè)定每孔的吸光度值，進(jìn)而計(jì)算H9c2細(xì)胞的存活率。1.2.5Hoechst33258染色觀察凋亡形態(tài)變化根據(jù)5104/ml接種于24孔板，細(xì)胞融合生長(zhǎng)至60%左右，經(jīng)過(guò)相應(yīng)處理，棄舊培養(yǎng)液，PBS輕輕漂洗1次，參加4%多聚甲醛固定15分鐘，PBS漂洗1次，2.5g/ml的Hoechst33258室溫避光染色15分鐘，PBS輕輕漂洗3次，每次5分鐘，然后每孔加400LPBS上熒光顯微鏡下觀察并拍照。1.2.6Annexin-V/PI雙染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率采用25cm2培養(yǎng)瓶培養(yǎng)心肌細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)至70%左右給予不同處理后，進(jìn)行胰酶消化，離心收集細(xì)胞，4℃預(yù)冷無(wú)菌的PBS漂洗細(xì)胞2遍，每組取總數(shù)為1106/ml的細(xì)胞待檢測(cè)，用250L結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，并使其濃度為2-5105/ml，取190L細(xì)胞懸液參加10L的AnnexinV-FITC，間隔3分鐘，再參加10L濃度為20g/ml的碘化丙錠〔PI〕，混勻后于室溫避光孵育15min，在流式反響管中參加400LPBS，輕輕混勻，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料均采用xs表示。多樣本均數(shù)比擬采用單因素方差分析(One-WayANOVA)，兩兩間均數(shù)的多重比擬采用LSD檢驗(yàn)，以P0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2、結(jié)果2.1H2O2預(yù)處理對(duì)氧化損傷H9c2細(xì)胞存活率的影響400mol/LH2O2處理H9c2心肌細(xì)胞6h，造成H9c2細(xì)胞的存活率降低至〔605〕%，與正常對(duì)照組〔100%〕相比，兩者有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異〔P0.05〕。而應(yīng)用25mol/LH2O2預(yù)處理90min能明顯對(duì)抗400mol/LH2O2氧化損傷降低細(xì)胞存活率的作用，能使細(xì)胞存活率提高到〔857〕%，與損傷組比擬具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異〔P0.05〕。25mol/LH2O2處理H9c2細(xì)胞90min的細(xì)胞存活率為〔982〕%，與正常對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異〔圖1〕。2.2H2O2預(yù)處理對(duì)H9c2細(xì)胞氧化損傷的影響正常對(duì)照組〔CTL組〕H9c2細(xì)胞的MDA含量比擬低為1.90.33nmol/mg，損傷組MDA的含量明顯升高達(dá)6.80.56nmol/mg，與損傷組比擬，25mol/LH2O2預(yù)處理后的MDA水平明顯升高達(dá)4.80.4nmol/mg〔P＜0.05〕，PC組與損傷組相比，MDA含量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔P＜0.05〕〔見(jiàn)圖2.A〕。CTL組H9c2細(xì)胞的SOD活性為1766.48U/mg，損傷組細(xì)胞的SOD活性顯著降低達(dá)12211.73U/mg；與損傷組比擬，PC組SOD活性明顯升高，數(shù)值為16010.27U/mg〔P0.05〕〔見(jiàn)圖2.B〕。2.3H2O2預(yù)處理減輕氧化損傷誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化正常對(duì)照組的H9c2細(xì)胞，光鏡下細(xì)胞呈梭桿形，排列整潔，肌束樣，細(xì)胞間隙嚴(yán)密〔圖3A〕，熒光顯微鏡下細(xì)胞核呈現(xiàn)大小均一，均勻熒光，無(wú)核固縮，為體積稍大的暗染核形態(tài)〔圖3B〕；400mol/LH2O2處理6h，導(dǎo)致細(xì)胞皺縮、細(xì)胞外觀形態(tài)扭曲〔圖3A〕，細(xì)胞核染色質(zhì)凝集，核固縮，核碎裂，呈現(xiàn)體積小而亮的核形態(tài)〔圖3B〕；而25mol/LH2O2預(yù)處理能明顯減輕400mol/LH2O2引起的以上形態(tài)變化〔圖3A和圖3B〕。2.4H2O2預(yù)處理減少氧化損悲傷肌細(xì)胞凋亡率流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率，正常對(duì)照組凋亡率為〔1.250.14〕%，損傷組凋亡率為〔14.81.06〕%，損傷組與正常對(duì)照組相比擬有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異〔P0.01〕，PC組凋亡率為〔6.420.71〕%，與損傷組相比擬有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異〔P0.01〕〔見(jiàn)圖4〕。3、討論溶栓、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈參與治療(PCI)、冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)等方式方法廣泛用于臨床急性心肌梗死的治療，對(duì)于恢復(fù)心肌的灌注、縮小心肌梗死范圍、保衛(wèi)心功能起著重要作用，但同時(shí)也出現(xiàn)了嚴(yán)重的再灌注損傷,研究發(fā)現(xiàn)急性心肌梗死冠脈再通后大約25%的心肌細(xì)胞死亡。怎樣防治心肌缺血再灌損傷，引起了人們高度的重視。當(dāng)前以為活性氧是缺血再灌注損傷的重要發(fā)病學(xué)環(huán)節(jié)，是引起心肌缺血再灌注的關(guān)鍵誘導(dǎo)因素。在缺血再灌注損傷中，復(fù)灌時(shí)期會(huì)產(chǎn)生大量活性氧，導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化、DNA損傷以及心肌細(xì)胞凋亡。H2O2是活性氧家族的重要成員之一，有關(guān)缺血再灌注損傷的研究多采用高濃度的H2O2來(lái)模擬氧化損傷模型。然而活性氧〔ROS〕除了具有促氧化損傷的不利影響外，近期研究還現(xiàn)低濃度活性氧具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和促細(xì)胞增殖作用，而高濃度活性氧促細(xì)胞死亡，且呈現(xiàn)明顯劑量效應(yīng)關(guān)系。本研究采用400mol/LH2O2作用6小時(shí)來(lái)構(gòu)建H9c2心肌細(xì)胞的氧化損傷模型，發(fā)現(xiàn)低濃度H2O2對(duì)H9c2心肌細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性，經(jīng)過(guò)25mol/LH2O2對(duì)H9c2心肌細(xì)胞進(jìn)行90分鐘的預(yù)處理，細(xì)胞存活率明顯升高，細(xì)胞凋亡明顯減少，顯示低濃度H2O2預(yù)處理具有顯著的心肌保衛(wèi)作用。Mo等對(duì)氧化損傷的PC12細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)低濃度H2O2有明顯的細(xì)胞保衛(wèi)作用?；钚匝跏侵冈谏矬w內(nèi)與氧代謝有關(guān)的含氧自由基和易構(gòu)成自由基的過(guò)氧化物的總稱(chēng)，氧化性質(zhì)非?；顫姡琑OS能導(dǎo)致心肌細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白質(zhì)交聯(lián)和降解、脫氧核糖核酸斷裂以及線粒體功能障礙。生理?xiàng)l件下，機(jī)體不斷產(chǎn)生活性氧，而體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)不斷去除活性氧，兩者處于動(dòng)態(tài)平衡中，不會(huì)損害機(jī)體；然而當(dāng)出現(xiàn)有害刺激時(shí)，才會(huì)產(chǎn)生大量活性氧，抗氧化系統(tǒng)去除能力有限，最終導(dǎo)致氧化損傷的發(fā)生。過(guò)量的活性氧與多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)絡(luò)，例如動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、心肌梗死和心力衰竭等，因而有很多學(xué)者在著手研究減輕活性氧損傷的策略。但是，近來(lái)有很多研究證實(shí)適量的活性氧是一種重要的介導(dǎo)保衛(wèi)作用的信號(hào)分子，具有積極的生理作用。Penna等以為適量ROS可作為信號(hào)分子，介入缺血前處理和缺氧后處理的心臟保衛(wèi)作用信號(hào)通路，介導(dǎo)心肌保衛(wèi)作用?；钚匝踹€是缺血后處理心肌保衛(wèi)作用信號(hào)通路的組成部分，介入傳導(dǎo)抗凋亡的保衛(wèi)作用。本研究中低濃度H2O2對(duì)氧化損傷的心肌細(xì)胞保衛(wèi)的同時(shí)，伴有SOD活性明顯升高，提示H2O2預(yù)處理可能通過(guò)增加SOD的活性，進(jìn)而抵御氧化損傷。綜上所述，25mol/LH2O2預(yù)處理能夠增加心肌細(xì)胞存活率，減少細(xì)胞凋亡形態(tài)的發(fā)生，降低氧化損傷的凋亡率，增加SOD的活性，減少M(fèi)DA的含量，對(duì)于氧化損傷的H9c2心肌細(xì)胞具有很好的保衛(wèi)作用，其機(jī)制可能是適量的活性氧作為抗氧化酶的信