探究ape-lin是否促進骨髓間充質干細胞的增殖,細胞生物學論文1993年ODown等[1]初次發(fā)現(xiàn)7次螺旋的跨膜區(qū)段組成的G蛋白偶聯(lián)受體APJ〔apelin-angioten-sinreceptor-like,APJ〕.1998年，Tatemoto等[2]從牛的胃蛋白提取并純化APJ的內源性配體apelin.Apelin/APJ系統(tǒng)組織分布廣泛，生物學功能多樣。研究發(fā)現(xiàn)，Apelin具有舒張血管、降低血壓、加強心肌收縮力、調節(jié)下丘腦-垂體激素釋放、抑制抗利尿激素的釋放、調節(jié)攝食攝水以及抵抗艾滋病毒侵入細胞等多種生物學效應。Apelin/APJ系統(tǒng)還介入糖尿病腎病、大血管并發(fā)癥、視網膜新生血管的發(fā)展，是一種重要的生理調節(jié)肽。Apelin/APJ系統(tǒng)具有促進細胞增殖的作用。Apelin在人的成骨細胞大量表示出，可刺激成骨細胞的增殖。在鼠的胃上皮細胞含有大量Apelin,并證明在體外Apelin刺激胃上皮細胞的增殖。Apelin具有血管生成因子的作用，研究發(fā)如今視網膜血管內皮細胞中，Apelin-13和Apelin-36呈濃度依靠性促進細胞遷移、增殖和毛細血管構成。骨髓間充質干細胞〔bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs〕主要來源于骨髓組織，具有多向分化潛能，增殖迅速、可塑性、可移植性及自我更新能力強。在體外可被誘導分化為成骨細胞、脂肪細胞、血管內皮細胞、神經元樣細胞等，這正是其多向分化潛能特點的具體表現(xiàn)出。文獻[3]報道apelin能夠介入多種細胞增殖的經過，但apelin能否能影響骨髓間充質干細胞的增殖尚不清楚，也未見相關報道。本文旨在探究ape-lin能否促進骨髓間充質干細胞的增殖。1材料與方式方法1.1試劑與材料Sprague-Dawley〔SD〕大鼠購自湖南農業(yè)大學動物部；Apelin-13多肽〔057-19〕購自美國PhoenixBiotech公司；培養(yǎng)基、血清、胰酶等均購自美國Gibco公司；MTT購自美國Sigma公司；GNP-9080隔水式恒溫培養(yǎng)箱〔上海精宏實驗設備有限公司〕;流式細胞儀〔美國BectonDickinson公司〕;酶標儀〔美國LabsystemDragon公司〕.1.2大鼠骨髓間充質干細胞的分離與培養(yǎng)將SD大鼠浸泡于75%醫(yī)用酒精中15min,在無菌條件下切開大鼠組織，取股骨，去除外表軟組織，沖出骨髓，接種于培養(yǎng)瓶。用含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，37℃5%CO2培育箱中孵育培養(yǎng)。當培養(yǎng)的原代細胞生長密度到達70%~80%以上后，棄去原培養(yǎng)液，用PBS洗2次，參加0.05%胰蛋白酶消化液，放置于CO2培養(yǎng)箱中孵育5min;用巴式吸管汲取培養(yǎng)基反復吹打培養(yǎng)瓶壁，當貼壁的細胞懸浮后，取懸浮液800r/min離心8min;棄去上清液，參加培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至細胞重新懸浮時，分瓶進行傳代培養(yǎng)。倒置顯微鏡觀察細胞生長狀態(tài)。1.3流式細胞術檢測細胞周期將細胞以1106cells/L接種于六孔板，直到細胞生長至70%~80%狀態(tài)時，用含有0.1%胎牛血清胞培養(yǎng)24h〔細胞同步化〕,然后分別參加不同濃度apelin-13繼續(xù)孵育24h后用胰酶消化并收集細胞，PBS洗兩遍，棄上清，參加1mL70%預冷乙醇中，吹打均勻，4℃固定12h.PBS洗滌去乙醇，1000r/min,5min,洗兩遍。0.5mLPBS重懸細胞，參加PI和RNaseA至終濃度50g/mL,37℃溫浴30min,上流式細胞儀測定細胞周期。1.2.3MTT比色法測定細胞增殖將細胞以1106cells/L的濃度接種在96孔板中，直到細胞生長至70%~80%狀態(tài)時，再用含有0.1%胎牛血清胞培養(yǎng)24h〔細胞同步化〕,然后分別參加不同濃度apelin-13繼續(xù)孵育24h,每孔參加濃度為5g/L的MTT20L,繼續(xù)培養(yǎng)3h,然后吸出孔內培養(yǎng)液后，參加DMSO在37℃中孵育15min以后將其震蕩混勻，再經酶聯(lián)免疫檢測儀測定OD值〔570nm處的檢測波長〕.1.2.4統(tǒng)計學分析使用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計與分析，數(shù)據以xs表示。組間比擬采用單因素方差分析，當P0.05即具有統(tǒng)計學意義。2結果2.1倒置顯微鏡觀察apelin-13對骨髓間充質干細胞增殖的影響分別采用不同濃度apelin-13〔0.1mol/L、1.0mol/L和10.0mol/L〕處理大鼠骨髓間充質干細胞24h后，倒置顯微鏡下觀察細胞增殖，結果提示：apelin-13顯著促大鼠骨髓間充質干細胞的增殖〔見圖1〕.2.1流式細胞術檢測apelin-13對骨髓間充質干細胞增殖的影響表1表示清楚，與對照組相比擬，ape-lin-13刺激后處于S期和G2-M期的細胞數(shù)目顯著增加，G0-G1期的細胞數(shù)目顯著減少。apelin-13刺激后增殖指數(shù)〔PI〕顯著增加。提示：apelin-13顯著促進大鼠骨髓間充質干細胞的增殖。2.2MTT法觀察apelin-13對大鼠骨髓間基質干細胞增殖的影響圖2表示清楚apelin-13〔0.1mol/L、1.0mol/L和10.0mol/L〕處理大鼠骨髓間充質干細胞后，呈濃度依靠性促進細胞的增殖，且在apelin-13濃度為1mol/L時，與對照組比擬差異有顯著性，在apelin-13濃度為10mol/L時促增殖作用最顯著。3討論血管緊張素受體樣受體APJ是一種孤兒G蛋白偶聯(lián)受體[1].Apelin是APJ受體當前已經知道的唯一內源性配體[2].大量實驗表示清楚，apelin促進血管平滑肌細胞、視網膜血管內皮細胞、胃腺上皮細胞、脂肪細胞、成骨細胞等增殖經過。這些線索提示ape-lin可能介入骨髓間充質干細胞的增殖。骨髓間充質干細胞具有多向分化潛能，具有快速增殖的能力，能夠在體外可被誘導分化為成骨細胞、脂肪細胞、血管內皮細胞、神經細胞等。骨髓間充質干細胞已在退行性及缺損性疾病、心血管疾病、肝移植、肺纖維化等疾病治療方面獲得良好效果。骨髓間充質干細胞的植入物具有修復動物骨缺損的能力。將人骨髓間充質干細胞在體外培養(yǎng)，并貼附于生物材料上修復大鼠股骨干骨缺損也獲得了好的效果。骨髓間充質干細胞在心梗后既能促進新血管的構成又有分化為心肌細胞的能力。Apelin促進細胞增殖[4-5],但apelin與骨髓間充質干細胞關系尚不清楚，本實驗采用不同方式方法初步證明apelin-13促進骨髓間充質干細胞增殖。分別給予ape-lin-13〔0.1mol/L、1mol/L、10mol/L〕處理細胞24h后，用流式細胞術和MTT比色法檢測到apelin-13顯著促進大鼠骨髓間充質干細胞的增殖，且在apelin-13濃度為1mol/L時，與對照組比擬有顯著性差異，10mol/L時增殖最顯著。以上結果表示清楚apelin-13呈濃度依靠性促骨髓間充質干細胞的增殖。骨髓間充質干細胞具有易獲得、易培養(yǎng)、低免疫原性、易于外源基因的轉入和表示出等特性，且具有自我更新能力，并能迅速增殖，在組織器官移植中具有重要的應用價值[6].Apelin能促進骨髓間充質干細胞的增殖，因而，高表示出apelin的骨髓間充質干細胞或許能作為理想的種子細胞被廣泛應用于組織工程、細胞移植、基因治療及器官移植等領域。但ape-lin是怎樣影響骨髓間充質干細胞增殖，其分子機制還有待將來的進一步討論。以下為參考文獻：[1]ODowdBF,HeiberM,ChanA,etal.Ahumangenethatshowsidentitywiththegeneencodingtheangiotensinre-ceptorislocatedonchromosome11[J].Gene,1993,136〔1-2〕:355-360.[2]TatemotoK,HosoyaM,HabataY,etal.IsolationandcharacterizationofanovelendogenouspeptideligandforthehumanAPJreceptor[J].BiochemBiophyResComm,1998,251〔2〕:471-476.[3]LiF,LiL,QinX,etal.Apelin-inducedvascularsmoothmusclecellproliferation:theregulationofcyclinD1[J].FrontBiosc,2008,13〔5〕:3786-3792.[4]LiL,XieF.Jagged-1/Notch3signalingtransductionpath-wayisinvolvedinapelin-13-inducedvascularsmoothmusclecellsproliferation[J].ActaBioBiophySin,2020,45〔10〕:875-881.[5]YangL,SuT,LvD,etal.ERK1/2mediateslungadeno-carcinomacellproliferationandautophagyinducedbyapelin-13[J].ActaBioBiophyS