第五章固相析出分離法第1頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一?通過(guò)改變?nèi)芤簵l件，使溶質(zhì)以固體形式從溶液中分出的操作技術(shù)。?鹽析法?有機(jī)溶劑沉淀法?等電點(diǎn)沉淀法?結(jié)晶法第2頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第一節(jié)鹽析法(saltprecipitation)定義：鹽析法是利用各種生物分子在濃鹽溶液中溶解度的差異，通過(guò)向溶液中引入一定數(shù)量的中性鹽，使目的物或雜蛋白以沉淀析出，達(dá)到純化目的的方法。優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、較少變性缺點(diǎn)：分辨率不高，要除鹽第3頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一兩種現(xiàn)象：鹽溶：低鹽情況，鹽離子強(qiáng)度的增高，蛋白質(zhì)溶解度增大鹽析：高鹽，鹽離子強(qiáng)度增加，蛋白質(zhì)溶解度減小第4頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一一、基本原理第5頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一原理?形成離子對(duì)，部分中和了蛋白質(zhì)的電性，排斥作用減弱而能相互靠攏，聚集起來(lái)。?中性鹽的親水性比蛋白質(zhì)大，使蛋白質(zhì)脫去了水化膜，使其沉淀。第6頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一在鹽析區(qū)，符合公式logS=β-KsμS——蛋白質(zhì)溶解度，g/L；μ—鹽離子強(qiáng)度,Ci——i離子濃度，mol/L；Zi——i離子化合價(jià)；β——常數(shù),為縱坐標(biāo)上的截距;Ks——鹽析常數(shù)。第7頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一β、KS?β為縱坐標(biāo)上的截距，是外推截距，與無(wú)機(jī)鹽種類(lèi)無(wú)關(guān)。?KS是鹽析常數(shù)，與蛋白質(zhì)和鹽的種類(lèi)有關(guān)，但與溫度和pH無(wú)關(guān)。?兩種類(lèi)型：（1）在一定的pH和溫度下改變離子強(qiáng)度（鹽濃度）進(jìn)行鹽析，稱(chēng)作KS鹽析法。（2）在一定離子強(qiáng)度下僅改變pH和溫度進(jìn)行鹽析，稱(chēng)作β鹽析法。第8頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一二、影響鹽析的因素（一）、無(wú)機(jī)鹽的種類(lèi)鹽析能力：半徑小的高價(jià)離子在鹽析時(shí)的作用較強(qiáng)，陰離子的鹽析效果比陽(yáng)離子好，尤其以高價(jià)陰離子更為明顯。

PO43-＞SO42―＞CH3COO―＞Cl―＞NO3―＞I―NH4+＞K+＞Na+＞Li+鹽析用鹽要考慮幾個(gè)因素：常用硫酸銨第9頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一(二）溶質(zhì)（蛋白質(zhì)等）種類(lèi)的影響第10頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一鹽析分布曲線(xiàn)第11頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（三）蛋白質(zhì)濃度的影響?蛋白質(zhì)濃度提高，鹽用量減少第12頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（四）溫度的影響?溫度的變化會(huì)影響β值。?在無(wú)鹽或稀鹽溶液中，大多數(shù)蛋白質(zhì)溶解度是隨溫度升高而增大的，但在高鹽溶液中常相反。第13頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（五）pH的影響?當(dāng)溶液的pH在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)附近時(shí)，β值最小。?利用β值最低點(diǎn)時(shí)pH的不同，可以分級(jí)沉淀蛋白質(zhì).第14頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一三、鹽析操作（一）鹽析用鹽的濃度表示固體粉末硫酸銨飽和溶液常用“飽和度”來(lái)表征硫酸銨在溶液中的最終濃度，25℃時(shí)(NH4)2SO4的飽和濃度為4.1mol／L，定義它為100%飽和度.第15頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第16頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（二）鹽析方法和注意事項(xiàng)1、分部鹽析法2、重復(fù)鹽析法3、反抽提法一定的鹽濃度下將目的蛋白夾帶一定量的雜蛋白一同沉淀。將沉淀用較低濃度鹽溶液平衡，溶出其中的雜蛋白。第17頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一分部鹽析法第18頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一反抽提法(RNA聚合酶)第19頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一注意事項(xiàng)?“局部過(guò)濃”?溫度（室溫）?分離方法第20頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第二節(jié)有機(jī)溶劑沉淀

(OrganicSolventPrecipitation)

?定義：向水溶液中加入一定量親水性的有機(jī)溶劑，降低溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出的分離純化方法。第21頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一一、基本原理1、降低了介質(zhì)的介電常數(shù)，使溶質(zhì)分子之間的靜電引力增加，聚集形成沉淀。2、水溶性有機(jī)溶劑本身的水合作用降低了自由水的濃度，壓縮了親水溶質(zhì)分子表面原有水化層的厚度，降低了它的親水性，導(dǎo)致脫水凝集。第22頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一一些溶劑的介電常數(shù)第23頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一?優(yōu)點(diǎn)：乙醇等有機(jī)溶劑易除去，產(chǎn)品更純凈；密度差較大，離心收集。?缺點(diǎn)：容易使蛋白質(zhì)變性，操作常需低溫，成本高，需防火防爆第24頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一二、影響沉淀效果的因素（一）有機(jī)溶劑種類(lèi)及用量常用的溶劑有乙醇、丙酮、甲醇等。（二）pH的影響許多蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)附近時(shí)溶解度最低，溶液pH應(yīng)在等電點(diǎn)附近，還須考慮蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。第25頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（三）溫度（低溫沉淀）

有機(jī)溶劑存在下，大多數(shù)蛋白質(zhì)的溶解度隨溫度降低而顯著地減小。（四）無(wú)機(jī)鹽的含量低鹽：有利于沉淀，還有保護(hù)蛋白質(zhì)，防止變性。高鹽：增大蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑―水溶液中的溶解度，沉淀物中可能夾帶鹽。第26頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（五）某些金屬離子的助沉淀作用

多價(jià)陽(yáng)離子，如Ca2+、Zn2+能與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)溶解度降低。胰島素精制：第27頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（六）樣品濃度濃度小時(shí)，增加溶劑投入量和損耗。濃度大時(shí)，增加共沉作用，降低分辨率。蛋白質(zhì)濃度0.5%～2%；粘多糖濃度1%～2%。第28頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第三節(jié)其它沉淀方法一、等電點(diǎn)沉淀法對(duì)于兩性物質(zhì)，等電點(diǎn)時(shí)凈電荷為零，分子間排斥電位降低，吸引力增大，能相互聚集起來(lái)，發(fā)生沉淀。雜蛋白第29頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一胰島素純化：

胰島素?pH8?除去堿性雜蛋白?pH3?除去酸性雜蛋白第30頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一二、成鹽沉淀法金屬離子沉淀：與生物分子的酸性功能團(tuán)作用的金屬?gòu)?fù)合鹽法；有機(jī)酸類(lèi)復(fù)合鹽沉淀:與生物分子的堿性功能團(tuán)作用的有機(jī)酸復(fù)合鹽法（如苦味酸鹽、苦酮酸鹽、丹寧酸鹽等）。第31頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一1．金屬離子沉淀：

Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Zn2+、Ca2+、Ba2+、Mg2+等；2．生成有機(jī)酸類(lèi)復(fù)合鹽沉淀（1）丹寧即鞣酸（2）雷凡諾（3）三氯乙酸（TCA）第32頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第33頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第34頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一三、親和沉淀

利用親和反應(yīng)原理，將配基與可溶性的載體偶聯(lián)后形成載體-配基復(fù)合物（親和沉淀劑），該復(fù)合物可選擇性地與蛋白質(zhì)結(jié)合，在一定條件下沉淀出來(lái)。中性可溶，酸性沉淀。第35頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第36頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一四、高分子聚合物沉淀水溶性非離子型高分子聚合物，如不同分子量的聚乙二醇（PEG）、葡聚糖、右旋糖苷硫酸酯等，能使蛋白質(zhì)水合作用減弱而發(fā)生沉淀。五、表面活性劑十六烷基三甲基季胺溴化物（CTAB）十六烷基氯化吡啶（CPC）酸性多糖第37頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第38頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一六、選擇性變性沉淀法?熱變性沉淀法?酸堿變性沉淀法?利用試劑（氯仿）第39頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一固相析出分離法?第一節(jié)鹽析法?第二節(jié)有機(jī)溶劑沉淀?第三節(jié)其它沉淀方法

一、等電點(diǎn)沉淀法二、成鹽沉淀法第40頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第四節(jié)結(jié)晶(crystallization)?定義：溶液中的溶質(zhì)在一定條件下因分子有規(guī)則的排列而結(jié)合成晶體。?通過(guò)結(jié)晶，溶液中的大部分雜質(zhì)會(huì)留在母液中，經(jīng)過(guò)濾、洗滌可得到純度高的晶體。第41頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一一、結(jié)晶過(guò)程指溶質(zhì)自動(dòng)從過(guò)飽和溶液中析出形成新相的過(guò)程。C2—小晶體的溶解度；C1—普通晶體的溶解度；ρ—晶體密度；M—晶體質(zhì)量；σ—晶體與溶液間的界面張力；γ2—小晶體的半徑；γ1—普通晶體的半徑；第42頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一結(jié)晶包括三個(gè)過(guò)程：(1)形成過(guò)飽和溶液;(2)晶核形成;(3)晶體生長(zhǎng)。第43頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一濃度溫度圖第44頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一二、過(guò)飽和溶液的形成(結(jié)晶方法)（一）、蒸發(fā)法（二）、溫度誘導(dǎo)法熱盒技術(shù)（三）、鹽析結(jié)晶法（四）、透析結(jié)晶法（五）、有機(jī)溶劑結(jié)晶法第45頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一溫度誘導(dǎo)法第46頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一鹽析結(jié)晶法第47頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一透析結(jié)晶法第48頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（六）、等電點(diǎn)法（七）、微量擴(kuò)散法（八）、化學(xué)反應(yīng)結(jié)晶法調(diào)節(jié)溶液的pH或向溶液中加入反應(yīng)劑，成新物質(zhì)，結(jié)晶析出。（九）、共沸蒸餾結(jié)晶第49頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一等電點(diǎn)法第50頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一化學(xué)反應(yīng)結(jié)晶法第51頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一綜合利用第52頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一三、提高晶體質(zhì)量的途徑

工業(yè)上通常希望得到粗大而均勻的晶體，便于過(guò)濾與洗滌。（一）、晶體大小影響晶體大小的主要因素有過(guò)飽和度、溫度、攪拌速度、晶種等。第53頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一晶種第54頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（二）、晶體形狀改變晶體外形，可用:選擇不同的溶劑、控制過(guò)飽和度、結(jié)晶溫度、調(diào)節(jié)溶液的pH和有目的地加入某種能改變晶形的雜質(zhì)等。（三）、晶體純度晶體表面具有一定的物理吸附能力。重結(jié)晶：即將晶體用合適的溶劑溶解再次結(jié)晶。第55頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一重結(jié)晶(recrystallization)?溶解度受溫度影響較大的物質(zhì)，將產(chǎn)品溶解在熱的溶劑中，緩慢降低溫度析出晶體。

?將溶質(zhì)溶于一種溶劑中，然后將第二種溶劑加熱后緩緩地加入，放置一段時(shí)間使結(jié)晶完全。第56頁(yè)，共58頁(yè)，2023年，2月20日，星期一紅霉素重結(jié)晶用于生物物質(zhì)重結(jié)晶的溶劑一般有蒸餾水、丙酮、石油醚、乙酸乙酯、低級(jí)醇等。第57頁(yè)，共58頁(yè)，202