紫外可見(jiàn)分光光度法課件1第1頁(yè)，共59頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第一節(jié)基本原理一、紫外-可見(jiàn)吸收光譜（UV-VIS光譜）紫外-可見(jiàn)分光光度法起源：價(jià)電子能級(jí)躍遷由于分子吸收紫外-可見(jiàn)光區(qū)的電磁輻射，分子中價(jià)電子（或外層電子）的能級(jí)躍遷而產(chǎn)生。紫外光譜—又稱(chēng)為電子光譜—分子吸收光譜問(wèn)題1：為何UV-Vis光譜吸收帶都比較寬??2第2頁(yè)，共59頁(yè)，2023年，2月20日，星期二

解答分子吸收紫外可見(jiàn)光時(shí)，不僅會(huì)引起電子能級(jí)的躍遷，振動(dòng)能級(jí)和轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)同時(shí)會(huì)發(fā)生躍遷。振動(dòng)能級(jí)的間隔要比電子能級(jí)的間隔小很多，轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)間隔更小。這樣對(duì)于某一電子能級(jí)的躍遷，由于同時(shí)伴隨著振、轉(zhuǎn)能級(jí)的躍遷，吸收光子的頻率就不是唯一的了，而是很多非常相近的頻率分布在一個(gè)較大的頻率范圍內(nèi)。在儀器的分辨率不是特別高時(shí)，這些頻率就看起來(lái)是連續(xù)的，從而形成帶狀光譜。

3第3頁(yè)，共59頁(yè)，2023年，2月20日，星期二吸收帶躍遷類(lèi)型官能團(tuán)lmaxeR帶n?p*雜原子不飽和基團(tuán)~300nm<102K帶p?p*共軛雙鍵>200nm>104B帶分子振動(dòng)轉(zhuǎn)動(dòng)能極苯環(huán)~256nm~200E帶p?p*苯環(huán)大p鍵E1:180nmE2:200nm4.7′1047000

二、吸收帶問(wèn)題2：當(dāng)溶劑極性增大時(shí)，為何K帶和R帶的間距減小??4第4頁(yè)，共59頁(yè)，2023年，2月20日，星期二

解答：影響吸收帶的因素共軛體系越長(zhǎng)，λmax↑→紅移，εmax↑—UV光譜的基本規(guī)律

溶劑極性增大

*的max

紅移n*的max

蘭移溶劑效應(yīng)溶劑極性增大，R帶和K帶間距離降低5第5頁(yè)，共59頁(yè)，2023年，2月20日，星期二6體系pH值的影響：例：苯酚

E2帶：λmax=211nm(ε6200)λmax=235nm(ε9400)B帶：λmax=270nm(ε1450)λmax=287nm(ε2600)pH值增大（加堿）→E2、B帶紅移，ε增大pH值降低（加酸）→E2、B帶藍(lán)移，ε減小例：苯胺

E2帶：λmax=230nm(ε8600)λmax=203nm(ε7500)B帶：λmax=280nm(ε1475)λmax=254nm(ε160)pH值降低（加酸）→E2、B帶藍(lán)移，ε減pH值增大（加堿）→E2、B帶紅移，ε增大第6頁(yè)，共59頁(yè)，2023年，2月20日，星期二儀器校正

1、波長(zhǎng)校正苯的吸收峰校正波長(zhǎng)（紫外光區(qū)）。在25ml容量瓶?jī)?nèi)，滴入一滴苯(A.R.)，用無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻后，以無(wú)水乙醇為空白，在200～280nm間用lcm石英池測(cè)定吸收度。如下：

229.2233.5238.9243.2248.5254.5260.6268.4精度(nm)±3.0………±3.0±3.5重現(xiàn)性(nm)±0.15………±0.15±0.20

2、吸收池的校正：配對(duì)（兩個(gè)吸收池T差值ΔT＜0.5%）第二節(jié)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)7第7頁(yè)，共59頁(yè)，2023年，2月20日，星期二84、吸收度的準(zhǔn)確度校正精密稱(chēng)取在120℃干燥至恒重的重鉻酸鉀基準(zhǔn)試劑0.2g(稱(chēng)準(zhǔn)至0.lmg)，置500ml容量瓶中，用0.02mol/LH2SO4液溶解，并稀釋至500ml，搖勻（貯備液）。取4m1貯備液稀釋稀釋25ml容量瓶中(64mg/L），在規(guī)定的波長(zhǎng)處測(cè)定并計(jì)算其吸光系數(shù)，并與規(guī)定的吸光系數(shù)比較，應(yīng)符合下表中規(guī)定。

波長(zhǎng)（nm）235（最?。?57（最大）313（最?。?50（最大）吸光系數(shù)

的規(guī)定值

124.5144.048.62106.6吸光系數(shù)

的許可范圍123.0~125.0142.8~146.247.0~50.3105.6~1083、雜散光校正：

1.2%KCl溶液，H2O空白，200nm；T1.0%試劑濃度%（g/ml）測(cè)定用波長(zhǎng)（nm）透光率（%）氯化鉀1.20200＜1.0碘化鈉1.00220＜0.8亞硝酸鈉5.00340＜0.8第8頁(yè)，共59頁(yè)，2023年，2月20日，星期二5.吸收值精度和儀器線(xiàn)性范圍精密稱(chēng)取在120℃干燥至恒重的重鉻酸鉀基準(zhǔn)試劑0.2g(稱(chēng)準(zhǔn)至0.lmg)，置500ml容量瓶中，用0.02mol/LH2SO4液溶解，并稀釋至500ml，搖勻（貯備液）。用刻度吸管精密量取上述重鉻酸鉀溶液1ml、2ml、3ml、…、10ml分別置于25ml容量瓶中，均用0.02mol/L的H2SO4稀釋至刻度，搖勻。(2)測(cè)定：選好配對(duì)的lcm石英比色池，以0.02mol/L的H2SO4為空白，選擇S值，掃描4m1貯備液制成的稀釋液在230～360nm間的UV光譜。(3)

將以上10種濃度作A-C曲線(xiàn)，求回歸直線(xiàn)方程。(4)計(jì)算：根據(jù)稱(chēng)樣及稀釋度，計(jì)算出各個(gè)的吸光系數(shù)，在直角坐標(biāo)紙上，以各吸光度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的吸光系數(shù)為縱坐標(biāo)，繪出吸光系數(shù)-吸光度曲線(xiàn)。一般來(lái)說(shuō)，儀器測(cè)出的吸光系數(shù)，在吸光度過(guò)小時(shí)，常偏高，過(guò)大時(shí)，常偏低，其間有一段平坦區(qū)，在這區(qū)間測(cè)出的吸光度計(jì)算出的吸光系數(shù)是一個(gè)常數(shù)，它與平均值的偏差不超過(guò)±0.2％的一段，為這臺(tái)儀器的線(xiàn)性范圍或最佳工作范圍。(1)溶液配制方法：第9頁(yè)，共59頁(yè)，2023年，2月20日，星期二第三節(jié)定性和定量分析一、定性分析二、定量分析定性鑒別純度檢查和雜質(zhì)限量測(cè)定單組分的定量方法多組分的定量方法10第10頁(yè)，共59頁(yè)，2023年，2月20日，星期二問(wèn)題3下列關(guān)于紫外光譜的敘述正確的是——A.兩個(gè)化合物相同，其紫外光譜應(yīng)完全相同。B.紫外光譜完全相同的兩個(gè)化合物，一定是同一化合物。C.兩個(gè)化合物相同，其紫外光譜不一定相同。D.紫外光譜完全相同的兩個(gè)化合物，不一定是同一化合物。

E.同一種化合物只要是在溶液中測(cè)定，則其紫外光譜總

是相同的。C相同物質(zhì)的吸收光譜的特征（λmax、λmin、λsh等）相同，當(dāng)濃度及測(cè)定條件相同時(shí)，吸收光譜才相同第11頁(yè)，共59頁(yè)，2023年，2月20日，星期二二、定量分析（一）單組分的定量方法1、吸光系數(shù)法2、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法3、對(duì)照法：外標(biāo)一點(diǎn)法組分λmax＞溶劑的截止波長(zhǎng)測(cè)定波長(zhǎng)選吸收最大，干擾最小12第12頁(yè)，共59頁(yè)，2023年，2月20日，星期二13拓展：導(dǎo)數(shù)光譜在中藥分析中的應(yīng)用實(shí)例圖1陳香白露片中橙皮甙的吸收光譜圖2陳香白露片中橙皮甙的導(dǎo)數(shù)光譜1.橙皮甙2.甘草浸膏1.橙皮甙2.甘草浸膏3.其余各組分+陳皮中的干擾組分3.其余各組分+陳皮中的干擾組分

△λ=10nm中間波長(zhǎng)λm1=274nm,λm2=254.5nmλm==274nm第13頁(yè)，共59頁(yè)，2023年，2月20日，星期二（一）旋光光譜(ORD)

有機(jī)化學(xué)知識(shí)回顧：

具有手性的有機(jī)分子和它的鏡像是對(duì)稱(chēng)的但不能互相重疊。當(dāng)平面偏振光通過(guò)它時(shí)，偏振面便發(fā)生旋轉(zhuǎn)，即所謂該物質(zhì)具有“旋光性”。我們將偏振面所旋轉(zhuǎn)的角度稱(chēng)之為旋光度，可用旋轉(zhuǎn)檢偏鏡進(jìn)行測(cè)定。從觀(guān)察者的角度看，當(dāng)檢偏鏡順時(shí)針?lè)较蛐D(zhuǎn)時(shí)，樣品稱(chēng)右旋(+)物質(zhì)，逆時(shí)針?lè)较蛐D(zhuǎn)時(shí)稱(chēng)左旋(一)物質(zhì)其他新型光度分析法手性化合物旋光鏡示意圖

第14頁(yè)，共59頁(yè)，2023年，2月20日，星期二

平面偏振光(即線(xiàn)偏振光)可看成是以相同的傳播速度前進(jìn)的左、右兩個(gè)圓偏振光的矢量和。介質(zhì)有對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)時(shí)，左旋圓偏振光和右旋圓偏振光的矢量和在同一個(gè)平面，是忽長(zhǎng)忽短周期性變化的一條線(xiàn)。旋光現(xiàn)象圖8-2平面偏振光和圓偏振光的關(guān)系

(a)平面偏振光；(b)左、右圓偏振光；(c)平面偏振光由相等的左、右圓偏振光合成第15頁(yè)，共59頁(yè)，2023年，2月20日，星期二介質(zhì)為有不對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)的晶體或手性化合物的溶液(旋光性物質(zhì))，如冰晶石或葡萄糖水溶液，左旋圓和右旋圓偏振光在介質(zhì)中的傳播速度不同(即折射率不同）使其矢量和偏離原來(lái)的偏振面，偏離程度隨光程增大而增大—旋光現(xiàn)象圖8-3平面偏振光在不對(duì)稱(chēng)介質(zhì)中傳播時(shí)發(fā)生旋轉(zhuǎn)以不同波長(zhǎng)的平面偏振光來(lái)測(cè)量化合物的比旋光度[α]λ并以[α]λ

或有關(guān)量作縱坐標(biāo)，波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)——旋光光譜[α]λ=(α實(shí)

/cl)×100

常以摩爾旋光度[φ]λ代替[α]λ

[φ]λ=[α]λ

/100旋光光譜（ORD）第16頁(yè)，共59頁(yè)，2023年，2月20日，星期二1）無(wú)發(fā)色團(tuán)的飽和化合物旋光值為負(fù)值的化合物，ORD譜線(xiàn)從紫外到可見(jiàn)區(qū)呈單調(diào)上升；旋光值為正的化合物是單調(diào)下降。兩種情況下都趨向和逼近0線(xiàn)，但不與0線(xiàn)相交，即譜線(xiàn)只是在一個(gè)相內(nèi)延伸，沒(méi)有峰也沒(méi)有谷——正常的或平坦的旋光譜線(xiàn)紫外和可見(jiàn)區(qū)的ORD圖8-4(+)和(-)丁醇-2的ORD譜線(xiàn)第17頁(yè)，共59頁(yè)，2023年，2月20日，星期二2）發(fā)色團(tuán)(如羰基)

R帶：270nm。ORD曲線(xiàn)在此處越過(guò)零點(diǎn)，進(jìn)入另一個(gè)相區(qū)。形成的一個(gè)峰和一個(gè)谷組成的ORD譜線(xiàn)—Cotton效應(yīng)譜線(xiàn)正的Cotton效應(yīng)：當(dāng)波長(zhǎng)由長(zhǎng)波一端向短波一端移動(dòng)時(shí)，

ORD譜線(xiàn)由峰向谷變化負(fù)的Cotton效應(yīng)：ORD譜線(xiàn)由谷向峰變化ORD譜線(xiàn)與零線(xiàn)相交點(diǎn)的波長(zhǎng)稱(chēng)為λK圖8-5樟腦酮的ORD譜線(xiàn)第18頁(yè)，共59頁(yè)，2023年，2月20日，星期二旋光光度計(jì)第19頁(yè)，共59頁(yè)，2023年，2月20日，星期二2.圓二色光譜(CD)

2.1原理旋光性有機(jī)分子對(duì)組成平面偏振光的左旋圓偏光和右旋圓偏光的摩爾吸光系數(shù)是不同的，即εL≠εR，——圓二色性。摩爾吸光系數(shù)之差△ε

=εL-εR，是隨入射偏振光的波長(zhǎng)變化而變化的。以△ε或有關(guān)量為縱坐標(biāo)，波長(zhǎng)(紫外可見(jiàn)光區(qū))為橫坐標(biāo)，得到的圖譜就叫圓二色光譜(CD)。圓二色性常用摩爾橢圓度[θ]來(lái)度量，它與摩爾吸光系數(shù)差之間的換算關(guān)系式為通常近似為第20頁(yè)，共59頁(yè)，2023年，2月20日，星期二2.圓二色光譜(CD)

2.2儀器圓二色光譜計(jì)示意圖

第21頁(yè)，共59頁(yè)，2023年，2月20日，星期二2.3CD的應(yīng)用—蛋白質(zhì)構(gòu)象研究中的應(yīng)用近年來(lái)人們發(fā)現(xiàn)瘋牛病、克-雅氏病和震顫病等神經(jīng)退行性疾病是由Prion病蛋白所致，而構(gòu)象變化在Prion病蛋白的致病因素中起著至關(guān)重要的作用。因此，蛋白質(zhì)的構(gòu)象對(duì)其生理功能的研究具有巨大意義。目前確定蛋白質(zhì)構(gòu)象最準(zhǔn)確的方法是X-射線(xiàn)晶體衍射，但對(duì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜柔性的生物大分子蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，得到所需的晶體結(jié)構(gòu)較為困難，二維、多維核磁共振技術(shù)能測(cè)出溶液狀態(tài)下較小蛋白質(zhì)的構(gòu)象，可是對(duì)分子量較大的蛋白質(zhì)的計(jì)算處理非常復(fù)雜，相比之下，圓二色光譜是研究稀溶液中蛋白質(zhì)構(gòu)象的一種快速、簡(jiǎn)單、較準(zhǔn)確的方法。

1969年Greenfield最早用CD光譜數(shù)據(jù)估計(jì)了蛋白質(zhì)的構(gòu)象。近十幾年以來(lái)，研究者發(fā)現(xiàn)，近紫外CD（250~320nm）作為一種靈敏的光譜探針，可反映蛋白質(zhì)中芳香氨基酸殘基、二硫鍵微環(huán)境的變化；遠(yuǎn)紫外區(qū)CD（178~250nm）反映肽鍵的圓二色性。第22頁(yè)，共59頁(yè)，2023年，2月20日，星期二2.3CD的應(yīng)用—蛋白質(zhì)構(gòu)象研究中的應(yīng)用

2.3.1蛋白質(zhì)的圓二色性在蛋白質(zhì)或多肽中，主要的光活性基團(tuán)是肽鏈骨架中的肽鍵，芳香氨基酸殘基及二硫橋鍵。當(dāng)平面圓偏振光通過(guò)這些光活性的生色基團(tuán)時(shí)，光活性中心對(duì)平面圓偏振光中的左、右圓偏振光的吸收不相同，產(chǎn)生吸收差值。由于這種吸收差的存在，造成了偏振光矢量的振幅差，圓偏振光變成了橢圓偏振光，這就是蛋白質(zhì)的圓二色性。圓二色性的大小也可用摩爾橢圓度[θ]來(lái)度量近似為第23頁(yè)，共59頁(yè)，2023年，2月20日，星期二2.3CD的應(yīng)用—蛋白質(zhì)構(gòu)象研究中的應(yīng)用

2.3.2蛋白質(zhì)的遠(yuǎn)UVCD—二級(jí)結(jié)構(gòu)

α-螺旋結(jié)構(gòu)在靠近192nm有一正的譜帶,在222和208nm處表現(xiàn)出兩個(gè)負(fù)的特征肩峰譜帶;β-折疊的CD譜在216nm有一負(fù)譜帶,在185~200nm有一正譜帶;β-轉(zhuǎn)角在206nm附近有一正CD譜帶，而左手螺旋P2結(jié)構(gòu)在相應(yīng)的位置有負(fù)的CD譜帶。因此，根據(jù)所測(cè)得蛋白質(zhì)或多肽的遠(yuǎn)紫外CD譜，能反映出蛋白質(zhì)或多肽鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)的信息。

第24頁(yè)，共59頁(yè)，2023年，2月20日，星期二2.2.3蛋白質(zhì)的遠(yuǎn)UVCD—三級(jí)結(jié)構(gòu)

全α型α+β型和α/β型蛋白在222nm和208nm都表現(xiàn)出明顯的負(fù)峰，而在190~195nm內(nèi)都有正峰。全α型蛋白的正、負(fù)CD信號(hào)交叉在低于172nm波長(zhǎng)處，若交叉發(fā)生在更高的波長(zhǎng)位置，則很可能是含有β型結(jié)構(gòu)。據(jù)此可區(qū)別全α型α+β型和α/β。圖2b中α型的溶菌酶和核糖核酸酶A及圖2c中α/β型的丙糖磷酸異構(gòu)酶、黃素氧化還原酶、枯草桿菌蛋白酶BPN’的正、負(fù)CD信號(hào)交叉都發(fā)生在高于172nm波長(zhǎng)處。比較圖2b和2c的差別可發(fā)現(xiàn)，222nm和208nm兩處的CD數(shù)據(jù)能區(qū)分α+β型和α/β兩種不同類(lèi)型的蛋白質(zhì)。α+β類(lèi)型的蛋白質(zhì)208nm比222nm的CD值要大，而α/β型蛋白的CD譜特征正好相反。而全β型蛋白缺乏象α-螺旋那樣明顯的CD特征。圖2d和2e中前血清蛋白和α-糜蛋白酶等全β型結(jié)構(gòu)的蛋白表現(xiàn)出不同的CD譜峰特征。第25頁(yè)，共59頁(yè)，2023年，2月20日，星期二1）紫外可見(jiàn)區(qū)域，用不同波長(zhǎng)的左、右旋圓偏振光測(cè)量CD和ORD的主要目的是研究有機(jī)化合物的構(gòu)型或構(gòu)象。在這方面，ORD和CD所提供的信息是等價(jià)的。2）200～800nm內(nèi)無(wú)特征吸收，ORD呈單調(diào)平滑曲線(xiàn)，CD近于水平直線(xiàn)。3）200～800nm內(nèi)有特征吸收，則ORD和CD都呈Cotton效應(yīng)4)當(dāng)ORD呈正的Cotton效應(yīng)時(shí)，相應(yīng)的CD也呈正的Cotton效應(yīng)5)理想情況下，UV吸收峰λmax、CD的△ε絕對(duì)值最大對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)(呈峰或谷處)及ORD的λK三者應(yīng)相等6)cotton效應(yīng)的正、負(fù)與化合物中靠近生色團(tuán)的手性中心的構(gòu)型有密切的聯(lián)系，在一定條件下可將不對(duì)稱(chēng)分子中某生色團(tuán)吸收峰的Cotton效應(yīng)的正、負(fù)號(hào)與該生色團(tuán)附近的手性中心的構(gòu)型聯(lián)系起來(lái)。旋光光譜、圓二色光譜、紫外光譜之間的關(guān)系第26頁(yè)，共59頁(yè)，2023年，2月20日，星期二圖8-7ORD、CD與UV譜線(xiàn)的關(guān)系圖8-8旋光譜(上)和圓二色光譜(下)與右旋發(fā)色團(tuán)(a)和左旋發(fā)色團(tuán)(b)對(duì)應(yīng)關(guān)系第27頁(yè)，共59頁(yè)，2023年，2月20日，星期二圖8-91R-(+)-2-苯駢降冰片的CD和UV譜正的CD譜相應(yīng)于R帶第28頁(yè)，共59頁(yè)，2023年，2月20日，星期二UV光譜的應(yīng)用—DNA與藥物相互作用研究進(jìn)展

DNA分子在260nm附近處有強(qiáng)吸收，可根據(jù)相互作用前后DNA或其他分子的吸收譜帶的變化對(duì)二者相互作用模式進(jìn)行判斷。(1)如導(dǎo)致分子的構(gòu)象變化對(duì)于UV來(lái)說(shuō)，則DNA的吸收光譜產(chǎn)生減色效應(yīng)及紅移現(xiàn)象；如破壞了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，則產(chǎn)生增色效應(yīng)。(2)金屬配合物等分子與DNA發(fā)生嵌插作用，則該分子的吸收光譜峰出現(xiàn)減色效應(yīng)和紅移現(xiàn)象；如該分子與DNA發(fā)生靜電作用或溝槽作用,則光譜峰出現(xiàn)較小的紅移，且減色效應(yīng)不明顯

。1、UV-VIS法2、圓二色光譜（CD）法圓二色光譜(CD)是以高頻變換的左旋或右旋偏振光為入射光，根據(jù)結(jié)合了小分子和沒(méi)有結(jié)合小分子的DNA在260nm處的吸收的改變得到有關(guān)其結(jié)構(gòu)的信息或?qū)σ恍┍旧頉](méi)有CD信號(hào)，但在與DNA結(jié)合后能產(chǎn)生誘導(dǎo)CD的分子，也可得到其結(jié)構(gòu)的信息。第29頁(yè)，共59頁(yè)，2023年，2月20日，星期二

甲萘威(carbaryl)雖然本身無(wú)明顯的致癌作用,但是其與亞硝酸鹽聯(lián)合作用時(shí)就具有致癌、致畸及誘變作用。通過(guò)紫外光譜法研究了甲萘威與DNA的相互作用.結(jié)果顯示,在甲萘威的作用下,DNA的吸收光譜出現(xiàn)增色與紅移現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持甲萘威能以嵌插方式與DNA形成加合物。

應(yīng)用實(shí)例1：光譜法研究甲萘威與DNA的相互作用第30頁(yè)，共59頁(yè)，2023年，2月20日，星期二

1.紫外可見(jiàn)吸收光譜

圖1為模擬生理?xiàng)l件下，大黃酸UV吸收光譜及大黃酸一BSA體系的UV吸收差譜。由圖可見(jiàn)，大黃酸220nm處吸收峰強(qiáng)度有規(guī)律地降低并且峰位發(fā)生紅移。說(shuō)明大黃酸與BSA之間有顯著的相互作用，同時(shí)也說(shuō)明它們的相互作用使該共軛體系的能級(jí)發(fā)生了明顯的變化。應(yīng)用實(shí)例2：光譜及電化學(xué)方法研究大黃酸與牛血清白蛋白的相互作用—光譜學(xué)與光譜分析,2011,31(9):2446-2449第31頁(yè)，共59頁(yè)，2023年，2月20日，星期二2.圓二色譜法

為研究大黃酸與BSA作用過(guò)程中BSA二級(jí)構(gòu)象的變化，對(duì)比測(cè)試了BSA及大黃酸-BSA體系的圓二色譜。由圖5看出應(yīng)用實(shí)例2：光譜及電化學(xué)方法研究大黃酸與牛血清白蛋白的相互作用b和C的CD波譜相對(duì)于a有明顯的紅移現(xiàn)象，表明大黃酸與BSA結(jié)合改變了BSA空間構(gòu)象。第32頁(yè)，共59頁(yè)，2023年，2月20日，星期二概念：在溶液中加入表面活性劑，不僅增溶，更重要的是增大傳統(tǒng)分光光度法的靈敏度。特點(diǎn)：摩爾吸光系數(shù)增大，峰紅移高配位、多元絡(luò)合物，分子截面積a大ε＝0.87×1020pa光吸收強(qiáng)度與整個(gè)光譜帶的積分吸收強(qiáng)度有關(guān)εmax與截面積有關(guān)，也受半峰頻寬的約束（一）膠束增溶分光光度法第四節(jié)拓展：其他新型光度分析法第33頁(yè)，共59頁(yè)，2023年，2月20日，星期二能顯著降低水的表面張力的物質(zhì)為表面活性劑SurfaceActiveMaterial表面活性劑-概念非表面活性劑無(wú)機(jī)鹽，蔗糖，甘露醇非表面活性劑醇，醛，酸，酯表面活性劑肥皂濃度在0.2%時(shí)表面張力降至40％分子結(jié)構(gòu)：兩親分子親水基hydrophilicgroup憎水基hydrophobicgroup第34頁(yè)，共59頁(yè)，2023年，2月20日，星期二離子與非離子型表面活性劑-分類(lèi)陽(yáng)離子型伯仲叔季胺鹽，烷基吡啶陰離子型羧、磺酸鹽，硫、磷酸酯鹽兩性型氨基酸、甜菜堿型非離子型聚氧乙烯、多元醇型第35頁(yè)，共59頁(yè)，2023年，2月20日，星期二表面活性劑-C.M.C.膠束的形成C.M.C.CriticalMicelleConcentration形成膠束所必需的最低濃度膠束增溶作用形成膠束后，難溶物水中溶解度顯著增大。微環(huán)境不同含不溶性脂肪醇的烷基硫酸鹽溶液稀釋?zhuān)儨啙釘M均相萃取第36頁(yè)，共59頁(yè)，2023年，2月20日，星期二埃鉻菁R＋Be2＋

(pH6.9)C.M.C.以上的Zeph存在，增敏Zeph氯化十四烷基二甲基芐基銨埃鉻菁R膠束增溶分光光度法-實(shí)例第37頁(yè)，共59頁(yè)，2023年，2月20日，星期二膠束增溶分光光度法-實(shí)例有Zeph595nm最大Be:ECR=1:1無(wú)Zeph522nm最大Be:ECR=1:2第38頁(yè)，共59頁(yè)，2023年，2月20日，星期二膠束增溶分光光度法-非離子型表面活性劑的增溶/增穩(wěn)/增敏實(shí)例金屬－雙硫腙體系傳統(tǒng)：用CHCl3或CCl4萃取TritonX-100增溶水相直接測(cè)定銅鋅等對(duì)-(1,1,3,3,-四甲基丁基)-苯基醚Fe(III)－SCN體系分級(jí)絡(luò)合，還原退色，10m退10％加TritonX-100靈敏度提高1倍，12h穩(wěn)定第39頁(yè)，共59頁(yè)，2023年，2月20日，星期二（二）流動(dòng)注射分光光度法優(yōu)點(diǎn)：分析速度快、準(zhǔn)確度和精密度高、節(jié)省試劑和樣品、可與各種檢測(cè)技術(shù)、分離技術(shù)結(jié)合。

廣泛應(yīng)用于快速分析、過(guò)程分析及在線(xiàn)分析。第40頁(yè)，共59頁(yè)，2023年，2月20日，星期二

2.2.第41頁(yè)，共59頁(yè)，2023年，2月20日，星期二

2.第42頁(yè)，共59頁(yè)，2023年，2月20日，星期二

2.第43頁(yè)，共59頁(yè)，2023年，2月20日，星期二（二）流動(dòng)注射分光光度法流動(dòng)注射分析方法的發(fā)展1.1連續(xù)流動(dòng)分析技術(shù)連續(xù)流動(dòng)分析技術(shù)(continuousflowanalysis，CFA)是基于在管道中將連續(xù)流動(dòng)的試樣溶液用空氣按一定的間隔規(guī)則地隔開(kāi)，然后按順序和比例混入試劑溶液，在通過(guò)混合圈的過(guò)程中完成反應(yīng)，除去氣泡后，進(jìn)入檢測(cè)器。這種技術(shù)采用空氣間隔能有效地防止各段試樣間的相互混合，因此它曾在自動(dòng)分析領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用，但氣泡的存在會(huì)帶來(lái)許多問(wèn)題。第44頁(yè)，共59頁(yè)，2023年，2月20日，星期二（二）流動(dòng)注射分光光度法流動(dòng)注射分析方法的發(fā)展1.2流動(dòng)注射分析技術(shù)

流動(dòng)注射分析技術(shù)(flowinjeetionanalysis，F(xiàn)IA)是在連續(xù)流動(dòng)分析技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。它是一種在沒(méi)有氣泡間隔的條件下進(jìn)行分析的方法。傳統(tǒng)的流動(dòng)注射分析系統(tǒng)是由多通道蠕動(dòng)泵、注入閥、反應(yīng)管、檢測(cè)器(如分光光度計(jì))及記錄儀組成。根據(jù)峰形信號(hào)與被測(cè)物濃度具有的相關(guān)性，利用峰面積或峰高可對(duì)被測(cè)物質(zhì)進(jìn)行定量分析。第45頁(yè)，共59頁(yè)，2023年，2月20日，星期二（二）流動(dòng)注射分光光度法流動(dòng)注射分析方法的發(fā)展1.3順序注射分析技術(shù)

1990年，RUZICKA和MARSHALL在流動(dòng)注射分析的基礎(chǔ)上發(fā)展了一個(gè)流動(dòng)注射分析的新分支—順序注射分析(sequentialinjectionanalysis，SIA)。順序注射分析系統(tǒng)的核心部分是多通道選擇閥，此閥的各個(gè)通道分別與檢測(cè)器、樣品、試劑等通道相連，通過(guò)泵的作用，順序從不同的通道吸入一定體積的區(qū)帶于泵與閥之間的儲(chǔ)存管中，在此過(guò)程中，試劑與試樣由于徑向擴(kuò)散和軸向?qū)α髯饔没旌?，一定時(shí)間后，將其推至檢測(cè)器測(cè)定。順序注射分析的突出優(yōu)點(diǎn)在于，它可以用同一裝置完成不同項(xiàng)目的分析而無(wú)需改變流路設(shè)置。第46頁(yè)，共59頁(yè)，2023年，2月20日，星期二（二）流動(dòng)注射分光光度法流動(dòng)注射分析方法的發(fā)展1.3流動(dòng)注射一可更新表面技術(shù)

流動(dòng)注射一可更新表面技術(shù)(flowinjectionrenewablesurfaceteehnique，F(xiàn)I-RST)或微珠注射技術(shù)(beadiniection，BI)是流動(dòng)注射微量分析的第3代技術(shù)。同樣具有多通道選擇閥，只是用微珠作為試劑的載體，試樣與試劑在微珠表面反應(yīng)并實(shí)時(shí)記錄，反應(yīng)結(jié)束后，系統(tǒng)將微珠自動(dòng)排廢。FI-RST以微珠作為微載體進(jìn)行溶液處理，自動(dòng)表面更新后操作，消除了順序注射分析中出現(xiàn)的分析過(guò)程中混合試劑之間的相互影響，而且也提高了分析的靈敏度。第47頁(yè)，共59頁(yè)，2023年，2月20日，星期二（二）流動(dòng)注射分光光度法流動(dòng)注射分析方法的發(fā)展1.4微全分析系統(tǒng)微全分析系統(tǒng)(micrototalanalysissystems)概念的提出，特別是微流控芯片的發(fā)展，使流動(dòng)注射分析系統(tǒng)走向微型化。它采用微加工方法在平板上制作出微米級(jí)結(jié)構(gòu)，由計(jì)算機(jī)控制試樣和試劑在這些微結(jié)構(gòu)中的流動(dòng)、分散、混合及反應(yīng)過(guò)程，是目前集成程度和自動(dòng)化程度最高的流動(dòng)注射分析系統(tǒng)。已在環(huán)境分析、生命科學(xué)及食品分析等領(lǐng)域顯示出巨大的優(yōu)越性。第48頁(yè)，共59頁(yè)，2023年，2月20日，星期二（二）流動(dòng)注射分光光度法

2.流動(dòng)注射分析與其他分析方法的聯(lián)用技術(shù)可與分光光度法、原子光譜法、電化學(xué)分析法、發(fā)光分析法、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(1CP-AES）、生物傳感器、毛細(xì)管電泳、免疫分析法等技術(shù)聯(lián)用，構(gòu)成完整的分析系統(tǒng)。流動(dòng)注射-分光光度法(flowinjection-spectro-photometry，F(xiàn)I-S)是應(yīng)用最普遍的一種聯(lián)用技術(shù)。該方法簡(jiǎn)便，價(jià)格低廉，可以方便地與信號(hào)處理系統(tǒng)連接。廣泛應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測(cè)、水質(zhì)重金屬檢測(cè)、食品安全監(jiān)測(cè)、藥物分析等領(lǐng)域。第49頁(yè)，共59頁(yè)，2023年，2月20日，星期二（二）流動(dòng)注射分光光度法

3.流動(dòng)注射分光光度法在藥物分析中的應(yīng)用

流動(dòng)注射可分為正相流動(dòng)注射分析(FIA)和反向流動(dòng)注射分析(r-FIA)，一般的FIA是指正相流動(dòng)注射，即將試樣注入閥內(nèi)與流動(dòng)的試劑混合的測(cè)定方法。而r-FIA是將試樣與試劑的位置對(duì)調(diào)，靈敏度高于FIA，而且節(jié)省試劑，常用于流動(dòng)注射分光光度法中。例：2007年，VanessaGKAlmeida等采用了r-FIA紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定抗利什曼蟲(chóng)的中銻的含量。靈敏度高，其檢測(cè)限可達(dá)29ng·mL，檢測(cè)速度達(dá)到63次每小時(shí)。MarcosGrtinhut4等建立了r-FIA紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定了尿樣中酚類(lèi)化合物的量，檢測(cè)限為7.7mg/L，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9％。Kleszczewski等采用流動(dòng)注射-分光光度法利用維生素C具有還原性的性質(zhì)測(cè)定人血清中維生素c，分析速度快、操作簡(jiǎn)單、靈敏度高，節(jié)約試劑等。Corominas等建立了FIA紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定藥物制劑中的青霉胺、異丙嗪和甲哌氟丙嗪，分析速度快(70個(gè)每小時(shí))。第50頁(yè)，共59頁(yè)，2023年，2月20日，星期二（二）流動(dòng)注射分光光度法

4.流動(dòng)注射分光光度法在藥物分析中的發(fā)展FIA紫外一可見(jiàn)分光光度法與各種在線(xiàn)分離富集、轉(zhuǎn)化技術(shù)相結(jié)合，如微波、多流路切換技術(shù)、離子交換柱、動(dòng)力學(xué)分析技術(shù)等，不僅可以進(jìn)行多組分的測(cè)定，而且可以進(jìn)行價(jià)態(tài)分析，提高分析的靈敏度和選擇性。

微波流動(dòng)注射技術(shù)解決了慢反應(yīng)過(guò)程的測(cè)定問(wèn)題，微波場(chǎng)能夠強(qiáng)烈加快金屬離子的反應(yīng)速度，由于微波對(duì)各種化學(xué)反應(yīng)速度的影響不同，因此可提高方法的選擇性和檢測(cè)的快速性，便于控制和檢測(cè)。HuaiwenWang建立了測(cè)定微量釕的微波流動(dòng)注射催化分光光度法，測(cè)定出釕的總量。因此將微波技術(shù)與FIA相結(jié)合（BIS—FI）建立測(cè)定微量貴重金屬離子的微波FIA新體系具有重要意義。MJRuedasRama等采用了BIS—FIA同時(shí)測(cè)定異丙嗪和三氟拉唑，此法利用三價(jià)鐵能將酚噻嗪類(lèi)藥物氧化，再通過(guò)傳感器信號(hào)的變化求出酚噻嗪類(lèi)藥物的含量，此分析方法靈敏度較高，分析速度快。第51頁(yè)，共59頁(yè)，2023年，2月20日，星期二1971年瑞典學(xué)者Engvail和Perlmann,荷蘭學(xué)者VanWeerman和Schuurs分別報(bào)道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測(cè)體液中微量物質(zhì)的固相免疫測(cè)定方法，即酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)。1.定義

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)又稱(chēng)光度酶聯(lián)免疫法，采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測(cè)物與酶連接，然后通過(guò)酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，對(duì)受檢物質(zhì)進(jìn)行定性或定量分析的一種檢測(cè)方法。優(yōu)勢(shì)：靈敏度高、特異性好、檢測(cè)速度快、檢測(cè)成本（三）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）第52頁(yè)，共59頁(yè)，2023年，2月20日，星期二2.特點(diǎn)

2.1可逆性抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的反應(yīng)是一種可逆的動(dòng)態(tài)平衡Ag+Ab≒Ag·Ab2.2高靈敏性由于酶的催化頻率很高，故可極大地放大反應(yīng)效果，從而使測(cè)定方法達(dá)到很高的靈敏度。2.3特異性抗原抗體的結(jié)合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結(jié)合位點(diǎn)之間?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型互補(bǔ)關(guān)系，具有高度的特異性。因此，在很多時(shí)候，測(cè)定某一特定的物質(zhì)不需分離待測(cè)物。（三）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）第53頁(yè)，共59頁(yè)，2023年，2月20日，星期二3.測(cè)定原理①使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，受檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗原或抗體與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。③用洗滌的方