第一章

核酸的化學(xué)ChemistryofNucleicAcid第一節(jié)核酸概述

(核酸的種類、分布和化學(xué)組成)第二節(jié)核酸的分子結(jié)構(gòu)第三節(jié)核酸的理化性質(zhì)第四節(jié)核酸的分析技術(shù)核酸(nucleicacid)

是以核苷酸為基本組成單位的生物大分子，攜帶和傳遞遺傳信息。第一節(jié)概述

一、核酸的發(fā)現(xiàn)和研究進(jìn)展1868年F.Miescher從膿細(xì)胞中提取“核素”1944年

Avery等人證實(shí)DNA是遺傳物質(zhì)(肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn))年Chargaffetal-Chargaff法則1953年

Watson和Crick提出DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)1968年Nirenberg發(fā)現(xiàn)遺傳密碼1981年Gilbert和Sanger建立DNA測序方法1985年Mullis發(fā)明PCR技術(shù)2000年完成人類基因組計(jì)劃基本框架Watson和Crick于1953年提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型,是進(jìn)入分子生物學(xué)時(shí)期的標(biāo)志。二、核酸的種類、分布和含量種類:分類的依據(jù)是戊糖的差異

DeoxyriboNucleicAcid（DNA）

RiboNucleicAcid（RNA）-----核酸的種類、分布和化學(xué)組成ribosomeRNA(rRNA)transferRNA(tRNA)messengerRNA(mRNA)種類及含量的差異?2.分布DNARNA

細(xì)胞核（%）98<10

細(xì)胞質(zhì)（%）2>903.含量DNA含量恒定，RNA與細(xì)胞生長狀態(tài)有關(guān)三、核酸的功能(一）DNA是主要的遺傳物質(zhì)1944年，O.T.Avery（美）肺炎鏈球菌的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn),首次證明DNA是細(xì)菌遺傳性狀的轉(zhuǎn)化因子1953年

Watson-Crick提出DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)RNA病毒朊病毒（二）RNA參與基因表達(dá)調(diào)控和蛋白質(zhì)合成三種主要RNA的比較tRNArRNAmRNA含量10-15%80%~5%數(shù)量多少（3－4）最多功能運(yùn)輸AA，具有反密碼子蛋白質(zhì)合成場所蛋白質(zhì)合成模板，具有密碼子

四、核酸的化學(xué)組成磷酸核苷（nucleoside)戊糖-ribose(R)deoxyribose(dR)

堿基

AGUCAGTC

核酸——多聚核苷酸（polynucleotides)n·核苷酸（nucleotide)（一）基本結(jié)構(gòu)單位——核苷酸嘌呤(purine)鳥嘌呤(guanine,G)1堿基9NNNHN12346587腺嘌呤(adenine,A)嘧啶(pyrimidine)NN654321尿嘧啶胸腺嘧啶胞嘧啶

uracilthyminecytosine—CH3UTC堿基2戊糖（構(gòu)成RNA）1′2′3′4′5′核糖(ribose)（構(gòu)成DNA）脫氧核糖(deoxyribose)3核苷

核苷(ribonucleoside)的形成堿基和核糖（脫氧核糖）通過糖苷鍵連接形成核苷（脫氧核苷）。1′11′9核苷酸：AMP,GMP,UMP,CMP脫氧核苷酸：dAMP,dGMP,dTMP,dCMP

4核苷酸(ribonucleotide)和修飾核苷酸核苷（脫氧核苷）和磷酸以磷酸酯鍵連接形成核苷酸（脫氧核苷酸）。

DNA、RNA組成異同 DNARNA磷酸磷酸磷酸戊糖2’-脫氧核糖（dR)核糖（R）堿基嘌呤A、GA、G

嘧啶C、TC、U修飾核苷酸甲基化（兩種寫法的區(qū)別,m2A

vsAm）假尿苷（）二氫尿嘧啶核苷（DHU）二氫尿嘧啶核苷（DHU）HHHH6體內(nèi)重要的游離核苷酸及其衍生物多磷酸核苷酸：NMP，NDP，NTP

dNMP,dNDP,dNTPAMP

環(huán)化核苷酸:cAMP，cGMPcAMP1）DNA\RNA組成2）多磷酸核苷酸，能量代謝

3）環(huán)核苷酸cAMP、cGMP第二信使

4）NAD\NADPFAD\FMN輔酶，生物氧化

小結(jié)：含核苷酸的生物活性物質(zhì)：

NAD+（輔酶I，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）NADP+(輔酶II，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸）CoA-SH（輔酶A）FMN／FAD

等都含有

AMP第二節(jié)核酸的分子結(jié)構(gòu)一、核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu):DNA或RNA分子中核苷酸的排列順序。由于核苷酸間的差異主要是堿基不同，所以也稱為堿基序列。核苷酸之間以磷酸二酯鍵連接形成多核苷酸鏈，即核酸。5′端3′端1、多聚核苷酸的連接(3’,5’磷酸二脂鍵）CGAAGP5PTPG

PC

PT

POH32、方向與書寫方法5pApGpTpGpCpT-OH

35AGTGCT

35′AGTGCT3′orAGTGCT3′TCACGA5′二、DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)(DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)）

(一)理論基礎(chǔ)

1、DNA的堿基組成（Chargaff法則）

[A][T]、[G][C]

[A]+[G][T]+[C]2、堿基之間以氫鍵連接3、X-光衍射數(shù)據(jù)：Wilkins&FranklinDNA可能有2條或2條以上具有螺旋結(jié)構(gòu)的多核苷酸鏈，螺旋直徑為2nm，沿DNA長軸有0.34nm和3.4nm兩個(gè)周期性變化。(二)

DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)——雙螺旋結(jié)構(gòu)1.DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn)（Watson,Crick,1953）1)雙螺旋是反平行雙鏈右手螺旋，形成相間的大溝(majorgroove)及小溝(minorgroove)。2)堿基平面與螺旋軸垂直,磷酸與脫氧核糖為DNA的骨架。3)螺旋直徑為2nm，相鄰堿基平面距離0.34nm，螺旋一圈螺距3.4nm，一圈10對(duì)堿基。4)兩條鏈之間通過A／T，G／C互補(bǔ)配對(duì)的氫鍵相連。2.維持DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定因素（1）、堿基內(nèi)氫鍵（2）、堿基堆集力是使DNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的主要因素（3）、磷酸基與介質(zhì)陽離子間的離子鍵3.DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的多樣性存在的意義？三DNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)1.DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)(superhelix或supercoil)DNA雙螺旋鏈再盤繞即形成超螺旋結(jié)構(gòu)。負(fù)超螺旋(negativesupercoil)盤繞方向與DNA雙螺旋方向相反,即左手超螺旋(常見).正超螺旋(positivesupercoil)盤繞方向與DNA雙螺旋方同相同,即右手超螺旋(目前僅嗜熱菌體內(nèi)存在).

意義DNA超螺旋結(jié)構(gòu)整體或局部的拓?fù)鋵W(xué)變化及其調(diào)控對(duì)于DNA復(fù)制和RNA轉(zhuǎn)錄過程具有關(guān)鍵作用。DNA的超級(jí)結(jié)構(gòu)與染色體的組裝四RNA的結(jié)構(gòu)與功能RNA的組成和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：核糖核苷酸按一定順序相連（3’，5’-磷酸二酯鍵）基本組成單位：AMP、GMP、CMP、UMP主要為單鏈（一）、mRNA的結(jié)構(gòu)與功能：真核生物中：1、5’帽：m7GpppNmP2、3’尾：polyA尾巴3、編碼區(qū)、非編碼區(qū)m7Gppp-AAAA…..A5’3’5’非編碼區(qū)3’非編碼區(qū)編碼區(qū)功能：合成蛋白質(zhì)的模板

結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：m7GpppAAAAAAAADNAhnRNAmRNAAUGUAGUAAUGA5UTRUnTranslationRegion3UTR外顯子內(nèi)含子（二）tRNA的結(jié)構(gòu)與功能：

功能：轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸至蛋白質(zhì)合成場所結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：1、由70－90個(gè)核苷酸組成;2、含10~20%的稀有堿基（DHU，假尿嘧啶，mG，mA）；3、二級(jí)結(jié)構(gòu)為三葉草形；4、含有四個(gè)臂和四個(gè)環(huán)；5、3’端為CCA-OH結(jié)構(gòu)，為接受AA的部位；6、反密碼子環(huán)含有反密碼子；7、三級(jí)結(jié)構(gòu)為倒L型。（三）、rRNA的結(jié)構(gòu)與功能：21種原核真核小亞基rRNA蛋白質(zhì)rRNA蛋白質(zhì)大亞基16S18S33種5S，23S5S，5.8S，28S49種34種大小30S40S大小50S60S核蛋白體大小70S80SrRNA+蛋白質(zhì)核糖體

核糖體的組成（蛋白質(zhì)合成的場所）沉降系數(shù)（S）：單位離心力場中沉降分子下沉的速度，常用來描述生物分子的大小。五、基因與基因組（自學(xué)）基因的概念、基因組計(jì)劃及其研究進(jìn)展第三節(jié)核酸的理化性質(zhì)一、兩性電解質(zhì)二、高分子性質(zhì)三、UV吸收260nm四、變性、復(fù)性與雜交

一、兩性電解質(zhì)

兩性電解質(zhì)\但酸性強(qiáng)

電泳行為---向正極移動(dòng)（pH7-8），移動(dòng)速率與分子大小、凝膠濃度、電流強(qiáng)度有關(guān)。

沉淀行為---（1）加鹽（中和電荷？）0.3MNaAC

；（2）乙醇純化總RNA電泳圖DNA電泳圖二、高分子性質(zhì)

粘度DNA>RNA

超離心沉降凝膠過濾（電泳）

三、UV吸收260nm嘌呤堿和嘧啶堿具有共軛雙鍵，在紫外波段具有強(qiáng)烈吸收，最大吸收值在260nm附近。核酸的UV吸收的應(yīng)用核酸濃度的測定雙鏈DNA：A260表示樣品的260nm吸收值為0.01，核酸的濃度為500ng/ml。

A260×（稀釋倍數(shù)）×50ug/ml

RNA：

A260×（稀釋倍數(shù)）×40ug/ml單鏈DNA：A260×（稀釋倍數(shù)）×33ug/ml寡核苷酸：A260×稀釋倍數(shù)×20ug/ml0.01核酸的純度A260/A280

DNA:1.8左右RNA：1.8-2.0

（一）變性(denaturation)核酸在理、化因素作用下，雙螺旋結(jié)構(gòu)破壞變成單鏈，但不涉及共價(jià)鍵的斷裂稱核酸變性。與降解的區(qū)別？引起的因素：化學(xué)因素：酸堿變性、尿素、甲醛變性物理因素：熱變性DNA的熱變性更具典型意義

四、變性、復(fù)性與分子雜交DNA的熱變性生物活性部分或完全喪失粘度改變，線性分子變得無序，粘度下降UV吸收增強(qiáng)，其規(guī)律如下：

●

增色效應(yīng)與減色效應(yīng)核酸變性后,氫鍵破壞，雙螺旋結(jié)構(gòu)破壞，堿基暴露，紫外吸收（260nm）增強(qiáng)，謂增色效應(yīng)減色效應(yīng)：核酸的光吸收值比其各核酸成分的光吸收值之和少，這是由于堿基有規(guī)律地堆積在一起造成的。

●解鏈溫度\熔解溫度(Tm)熱變性過程中光吸收達(dá)到最大吸收值（完全變性）的50%時(shí)的溫度，稱Tm8090100100%50%A260

Tm

變性溫度范圍①②③℃Tm值:

DNA(G+C)含量有關(guān)，G+C含量愈大，Tm愈高

?與核酸分子的均一性有關(guān)，均一性愈強(qiáng)，Tm愈低。與介質(zhì)離子強(qiáng)度成正比DNA發(fā)生熱變性后，經(jīng)緩慢降溫，如放置室溫逐漸冷卻，解開的互補(bǔ)鏈之間對(duì)應(yīng)的堿基對(duì)再形成氫鍵，恢復(fù)完整的雙螺旋結(jié)構(gòu)，稱DNA熱變性的復(fù)性。核酸復(fù)性時(shí)對(duì)UV的吸收下降，發(fā)生減色效應(yīng)（二）DNA的復(fù)性

(renaturation)退火：DNA熱變性后緩慢冷卻恢復(fù)成雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程(annealing).

DNA加熱變性后，若經(jīng)驟然降溫，互補(bǔ)鏈堿基之間來不及配對(duì)互補(bǔ)，兩鏈維持分離狀態(tài)。慢驟

（三）核酸分子雜交hybridization

當(dāng)不同來源的核酸變性后一起復(fù)性時(shí)，只要這些核酸分子中含有相同序列的片段，即可形成堿基配對(duì)，出現(xiàn)復(fù)性現(xiàn)象，形成雜種核酸分子，或稱雜化雙鏈，稱核酸分子雜交。DNA-DNA

SouthernblottingDNA-RNANorthernblottingAnyoneelse?第四節(jié)核酸的分析技術(shù)（自學(xué)）一核酸雜交與基因芯片技術(shù)二DNA的體外擴(kuò)增三DNA的測序一核酸雜交與基因芯片（a）（b）（c）（d）（e）基因組DNADNA限制片段硝酸纖維素濾膜同探針同源雜交的基因DNA片段X光底片SouthernBlotting二D