MLVA分型技術和實驗操作步驟演示文稿1目前一頁\總數(shù)四十七頁\編于十四點2MLVA分型技術和實驗操作步驟目前二頁\總數(shù)四十七頁\編于十四點病原菌分子分型的目的長期研究病原菌的遺傳進化病原菌適應來自宿主的高選擇性壓力因點突變、重組（包括基因轉移）等遺傳變異

短期研究了解病原菌的適應性感染溯源目前三頁\總數(shù)四十七頁\編于十四點分子分型方法序列或分類資料為基礎的等位基因：多位點序列分析（multilocussequencetyping，MLST）多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復序列分析（Multiple-LocusVariable-numbertandem-repeatAnalysis,MLVA）

圖像分析：脈沖場凝膠電泳（PFGE)隨機擴增多態(tài)性DNA分析（randomamplifiedpolymorphicDNA，RAPD)擴增片斷長度多態(tài)性分析（amplifiedfragmentlengthpolymorphism,AFLP）核糖體分型（ribotyping）等目前四頁\總數(shù)四十七頁\編于十四點MLST

結果無偏性unambiguousresults有相應的數(shù)據(jù)庫支持internationaldatabases區(qū)分度低，Lowdiscriminationpower高花費，highcost:sequencing不適合常規(guī)檢測和暴發(fā)調查，unsuitableforroutinesurveillanceandepidemiologicalstudies目前五頁\總數(shù)四十七頁\編于十四點VNTRVNTR：可變數(shù)目出那里重復序列，VariableNumberofTandemRepeats

AACTTTACGTTCAAATTAACGTTCAAATTAACGTTCAAATTTACCTTG

側翼序列重復單元目前六頁\總數(shù)四十七頁\編于十四點18bp*3AACCTAAACAGACCATGGCGCTGGGCTGCTGGAGCGAGCAGGAGCTGGTGGGCGAGCAGGAGCTGGTGGGCGAGCAGGAGCTGGTGGGCGAGCAGGGAVNTR產(chǎn)生的原因：聚合酶的滑鏈復制目前七頁\總數(shù)四十七頁\編于十四點

100bp200bp

300bpGelmigrationStrainCDC1551:5x15bpStrainH37Rv:4x15bpstrainCDC1551:230bpstrainH37Rv:215bp230bp215bp200bpPCRprimers:CTCCCACACCCAGGACAC

CGGCCTACCCAACATTCCPCR215bp230bp

TRF軟件（TandemRepeatsFindersoftware），

://minisatellites.u-psud.fr/VNTR位點的確定測序分析目前八頁\總數(shù)四十七頁\編于十四點VNTR和等位基因atgggtaatccgtcgACGCACGCACGCgccaatcgatacgatPrimer-F上游序列VNTR重復下游序列重復拷貝數(shù)=擴增大小-上下游序列

重復單元的大小Primer-R

取整：就近取整或去除小數(shù)取整目前九頁\總數(shù)四十七頁\編于十四點串聯(lián)重復序列可變重復數(shù)目的判定目前十頁\總數(shù)四十七頁\編于十四點MLVA方法多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復序列分析可變數(shù)目串聯(lián)重復：VNTR：MLVA方法：即VNTR的數(shù)組例如：MLVA1型735266210233136ST1++-MLVA1型別菌株血清型TR1TR2TR3TR4TR5TR6TR7TR8TR9MLST其他特征MLVA1410461531.719123026ST81---目前十一頁\總數(shù)四十七頁\編于十四點分析軟件：BioNumerics

命名MLVA型：MT1-MT85

評價各位點的分辨力：

Nei’sindex=1-Σ(allelefrequency)2

評價MLVA方法的分辨力：

Simpson'sindex=1-Σ[nj(nj-1)]/[N(N-1)]

聚類分析構建最小生成樹目前十二頁\總數(shù)四十七頁\編于十四點MLVA實驗操作一、模板制備：DNA提取模板或水煮模板二、PCR擴增多重PCR反應三、擴增條帶大小判斷：（一）毛細管電泳：

1.引物標記

2.多種不同的熒光染料標記上游引物（FAM、HEX和TAMRA）

3.ABI3730系統(tǒng)進行分析，用內標（ABI自帶）（二）普通電泳分析（三）測序分析目前十三頁\總數(shù)四十七頁\編于十四點MLVA實驗步驟-PCR2個PCR體系/多重PCR體系：體系（20ul）指標BufferdNTP上下游引物10uM（個ul）酶模板ulTm延伸時間循環(huán)數(shù)片段大小判斷方式A1TR2-FAM2.0u0.756℃40秒30毛細管電泳TR4-HEX0.3A2TR1-FAM2.0u0.757℃40秒30毛細管電泳TR3-HEX0.3模板制備：DNA提取模板

水煮模板目前十四頁\總數(shù)四十七頁\編于十四點擴增條帶大小判斷：

（一）毛細管電泳：

1.引物標記

2.多種不同的熒光染料標記上游引物（FAM、HEX和TAMRA）

3.ABI3730系統(tǒng)進行分析，用內標（ABI自帶）（二）普通電泳分析（三）測序分析目前十五頁\總數(shù)四十七頁\編于十四點用500liz內標標定擴增片段大小用genemap軟件分析毛細管電泳圖用毛細管電泳來判斷片段大小目前十六頁\總數(shù)四十七頁\編于十四點MLVA聚類分析Bionumerics軟件（version4.64）效用均等的分類資料的分析方法（

UPGMA）(unweightedpairgroupmethodusingarithmeticaverages)

等分權重分類圖/最小生成樹的形式展現(xiàn)多態(tài)性指數(shù)：Simpson’sindex

目前十七頁\總數(shù)四十七頁\編于十四點MLVA方法的應用Neisseriameningitidis(23)

Streptococcuspneumoniae(20),Streptococcusuberis(12),

SalmonellaEnteritidis(10),

Salmonellaenterica(5,35),

Listeriamonocytogenes(28,29,39),

Legionellapneumophila(33),Clostridiumperfringens(37),Leptospirainterrogan(38,38),

EscherichiacoliO157:H7(30,46),

Clostridiumdifficile(43),Burkholderiapseudomallei(42),

Pseudomonasaeruginosa(32),Shigellaspp(13)et.al..

目前十八頁\總數(shù)四十七頁\編于十四點分型方法評價標準

區(qū)分度(discriminatorypower)數(shù)字化數(shù)據(jù)庫適合實驗室間比對（comparebetweenlaboratories）重復性（Reproducible）流行病學相關性（epidemiologicalconcordance）

方便快速（convenienceandrapidity）穩(wěn)定性（stability）容易解釋（easytointerpret）花費技術難度目前十九頁\總數(shù)四十七頁\編于十四點MLVA方法的好處上述的優(yōu)點具有彈性flexibility.不需要參考菌株作為參照目前二十頁\總數(shù)四十七頁\編于十四點第二部分發(fā)展一種新的MLVA方法目前二十一頁\總數(shù)四十七頁\編于十四點基于序列的比較初篩多態(tài)性VNTR位點的PCR鑒定和篩選

核酸測序確定重復模式區(qū)分效能評價系統(tǒng)測試篩選多態(tài)性VNTR得分大于70，拷貝數(shù)大于3，同源性大于75%

選擇出114位點現(xiàn)實的模板擴篩選

33血清型和21個豬鏈球菌2型

36個電泳行為不同確認重復序列和重復單元數(shù)14個確定指標9個指標的MLVA策略目前二十二頁\總數(shù)四十七頁\編于十四點TRF軟件（TandemRepeatsFindersoftware）://minisatellites.u-psud.fr/串聯(lián)重復的鑒定匹配賦2分不匹配-3分堿基缺失-5分最小報告分值50分以豬鏈球菌為例：鑒定了750,749,790,784測序菌株基因組串聯(lián)重復位點的比較菌株名稱血清型來源ST型GZ12(CP000837)ST1P1/72(www.sanger.ac.uk)ST105ZYH332(NC_009442)ST798HAH122(NC_009443)ST7SC842ST7目前二十三頁\總數(shù)四十七頁\編于十四點串聯(lián)重復的鑒定目前二十四頁\總數(shù)四十七頁\編于十四點串聯(lián)重復的鑒定IndicesPeriod

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NumberConsensus

SizePercent

MatchesPercent

IndelsScoreACGTEntropy

(0-2)1858865--1858900123.0127005236533251.791862974--1863158463.946784228222312401.891867321--1867363162.61670752252513341.93目前二十五頁\總數(shù)四十七頁\編于十四點串聯(lián)重復的鑒定目前二十六頁\總數(shù)四十七頁\編于十四點目前二十七頁\總數(shù)四十七頁\編于十四點insertedasmallsegment

泳道1234567891011121314菌號SC22NJ2598029801GZ189-1591P1/7R735ATCC4376511611HASS-73SC061001SC0623806GZ115161718192021222324LN1GX2CQ1GZ2SC17SC8443800324380026RC4716Gx407目前二十八頁\總數(shù)四十七頁\編于十四點目前二十九頁\總數(shù)四十七頁\編于十四點多種重復模式IndicesPeriod

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NumberConsensus

SizePercent

MatchesPercent

IndelsScoreACGTEntropy

(0-2)217182--217298244.524611896271635211.94217182--217291158.114571877271735201.94217221--217313392.439941171251634231.95217185--217309129.712581487271634211.95TR2目前三十頁\總數(shù)四十七頁\編于十四點第三部分MLVA方法在豬鏈球菌分型中的應用目前三十一頁\總數(shù)四十七頁\編于十四點豬鏈球菌暴發(fā)疫情2005年-四川人感染豬鏈球菌暴發(fā)疫情215人感染、39人死亡波及四川36個縣的202個村莊

重慶，貴州，廣東，江西也發(fā)現(xiàn)病例江蘇1998暴發(fā)疫情25感染/14死亡Yu,H.,H.Jing,Z.Chen,etal.2006.HumanStreptococcussuisoutbreak,四川,China.Emerg.Infect.Dis.12:914-920目前三十二頁\總數(shù)四十七頁\編于十四點中國豬鏈球菌PFGE型別SmaI酶切：ST7型分為單一的PFGE-01型2005，2006年和2007年中國ST7菌株：PFGE-01型Ye,etal.2006.Emerg.Infect.Dis.目前三十三頁\總數(shù)四十七頁\編于十四點codeLocus§LocationinGZ1MatchesInGZ1%TandemrepeatsequenceTm℃Simpson’sindex%?TR1SSTR135_111bp_445_3u135784..13622864CGTTAAGCAAATCCTAGACAAAATAGGAAATCGAAGCAGATAGCTTCAATCAAGGAGATTTATCTTTTTGCCAGAATTTGTAGCTCGAATTCAACTAAGATTAAGATAGAGGA604.7TR2SSTR218_39bp_210_2.7u218682..21889194AGCAGCCTGTAGTTGAGGCACCTGTAGAGGAAGTTGTAG588.2TR3SSTR1675_102bp_287_2u1675611..167589788CAAGAAAAAATGGTCCATTCTCGCCGTTGCGCCTTTCCAGTTTCTTGGGCG605.9TR4SSTR1260_90bp_928_7u1259913..26084084ATATTGAAACCTCTGAAAAACAGATGCCAAGTATTGTGAACGACAATGTCGTAACACCTGAAAAGCAAATGGCTAATAAAGAGAACGATA558.3TR5SSTR69_49bp_352_2u69283..6963489AAGGTCCGGTGGACCTTTTTATCATGAGCATGAAAACAAGAAAGCGAATT605.9TR6SSTR928_30bp_172_2u927971..928142100CGTTGCTGGTACCGTAGCAGTTGCATCAGT607.0TR7SSTR127_10bp_134_4u127866..12799996AAAATATAGA587.1TR8SSTR260_231bp_677_2u260573..26124980CCAGAAGAGCCAAAACAAGACGCTCCACAAGCGCCATCAACACCGGAAAAACAAACAGAAGAACCGAACAAGGAAGAACCTAAGAAAACACCACAAGCGCCATCGACTCCGGAAAAACAACCAGAAGTACCGGAATCACCAAACCCAGAGACACCAGACGCGCCATCGACTCCAAAAGATGAACCGCAAGCTCCATCAATCCCAGAAGAAAAACCAAAAGTA5522.7TR9SSTR709_5bp_354_38u709802..710155100GAGCA5896.1豬鏈球菌MLVA指標和特征上游引物標記：FAM/HEX/TAMRA.多重PCRsM1和M2用毛細管電泳M3用普通電泳法TR1~8低或中等變異度指標TR9高變異度指標(value0.96).

目前三十四頁\總數(shù)四十七頁\編于十四點指標的等位基因型目前三十五頁\總數(shù)四十七頁\編于十四點166株豬鏈球菌血清2型的MLVA分型

目前三十六頁\總數(shù)四十七頁\編于十四點目前三十七頁\總數(shù)四十七頁\編于十四點目前三十八頁\總數(shù)四十七頁\編于十四點2005年江西豬鏈疫情的分析冷庫的搬運工：JX1冷庫豬肉：Jxs1，Jxs2，Jxs3共同的型別MLVA31.江西病豬來源于江蘇1998年的三株江蘇菌株和2005年的江蘇菌株也為MLVA31型。目前三十九頁\總數(shù)四十七頁\編于十四點輸入性人感染豬鏈球菌分析