------------------------------------------------------------------------乳制品中抗生素殘留現(xiàn)狀及其檢測方法乳制品中抗生素殘留現(xiàn)狀及其檢測方法摘要：抗生素殘留不僅危害人類健康，同時也影響牛奶的品質(zhì)，造成經(jīng)濟損失。本文綜述了乳制品中抗生素殘留的來源現(xiàn)狀和危害，以及各種抗生素殘留的檢測方法。關(guān)鍵詞：乳制品；抗生素殘留；檢測方法

牛乳是營養(yǎng)豐富的天然食品，鮮乳中有上百種化學(xué)成分，總?cè)楣腆w平均質(zhì)量分數(shù)為13.0%，其中脂肪4.0%、蛋白質(zhì)3.4%、乳糖4.8%、無機鹽0.8%（其中Ca0.11%），含有幾乎所有的脂溶性和水溶性維生素［1］。含有幾乎人體所需的全部營養(yǎng)素及具有保健功能的生物活性物質(zhì)。牛乳可謂是最好的鈣源，同時，乳品能提高免疫力、降低膽固醇、防治動脈硬化、心血管系統(tǒng)疾病、抗胃潰瘍等。酸乳還有延年益壽、抑制腫瘤生長的作用［2］。牛初乳中含有25種礦物質(zhì)，Ca、P、Na、Zn、Fe、Mn等的含量明顯高于常乳，蛋白質(zhì)含量是正常乳的8倍，乳糖含量低，富含維生素，同時含有免疫球蛋白、脯氨酸多肽（PRO）、類胰蛋白酶生長因子（IGF-1）、神經(jīng)營養(yǎng)生長因子（NGF）、表皮生長因子（EGF）、乳酸過氧化物、核苷及皮質(zhì)醇、酶等多種生物活性物質(zhì)。利用免疫乳生產(chǎn)技術(shù)提升初乳中免疫物質(zhì)含量［3］，對甲、乙型肝炎，霍亂，流感等傳染性疾病，對腦、心、肺血管內(nèi)科病，對隱性孢子寄生蟲病，對齲齒口腔病和各種炎癥感染等等都有非常明顯的醫(yī)療功能作用［4］。抗生素殘留現(xiàn)狀乳制品及乳制品工業(yè)發(fā)展迅速的同時，畜牧業(yè)也發(fā)展迅猛，β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類等抗生素在乳畜飼養(yǎng)業(yè)中廣泛應(yīng)用，而抗生素在畜牧業(yè)中的廣泛應(yīng)用，不可避免地造成牛奶中殘留抗生素?？股貧埩舨粌H危害人類健康，同時也影響牛奶的品質(zhì)，造成經(jīng)濟損失。我國乳制品中抗生素的殘留現(xiàn)狀不容樂觀，2006年的一份對北京、天津、石家莊5個零售點的77個牛奶樣品進行β-內(nèi)酰胺酶的殘留檢測，63.6%的樣品檢測為陽性。一項對我國幾個大城市如西寧、南寧、廣州、杭州、泉州、北京等城市乳制品質(zhì)量的檢測調(diào)查結(jié)果顯示，在近八百份乳品采樣中，抗生素殘留超標居不合格項目第一位。乳及乳制品中抗生素殘留，給消費者健康帶來了潛在威脅，因而提高抗生素殘留的檢測技術(shù)顯得尤其重要，盡快開發(fā)或引進先進的抗生素檢測技術(shù)以解決我國當前乳和乳制品行業(yè)面臨的難題已成為當務(wù)之急。

抗生素殘留的來源及其危害一般認為，對泌乳牛用藥不當或不注意安全時間是牛乳中抗生素殘留的重要因素，使用抗生素防治動物疫病。對患病奶牛用藥不當及不遵守停藥期是造成牛奶中抗生素殘留的重要因素。尤其是使用乳房灌注法治療乳腺炎時，易造成牛乳中抗生素殘留。隨著畜牧業(yè)的發(fā)展，在牛飼料中添加飼料添加劑已十分廣泛，其中含量有一定比例的抗生素，主要作用是預(yù)防疾病的發(fā)生，這也是牛乳抗生素殘留重要原因。此外，在高溫季節(jié)，一些不法交奶戶為防止乳的酸敗，往往向牛乳中摻雜各種抗生素，來抑制微生物的生長、繁殖，防止牛奶酸敗變質(zhì)這也是乳中抗生素殘留的一個來源。牛奶是老少皆宜的營養(yǎng)品，牛奶中若含有抗生素，對長期飲用者來說無疑是等于長期服用小劑量的抗生素，對抗生素有過敏體質(zhì)的人服用殘留抗生素的乳后會發(fā)生過敏反應(yīng)。即使是正常飲用者，體內(nèi)的某些條件性致病菌易產(chǎn)生耐藥性，一旦患病再用同種抗生素治療很難奏效?？股厥悄膛鲋委熑榉垦椎某Ｒ?guī)藥物，由于長期大量使用，使耐藥菌株增加，一些乳房炎病例變得難以用常規(guī)方法治愈。這種情況又促使臨診獸醫(yī)在治療過程中加大抗生素的用量。此外，牛奶中抗生素殘留會影響奶制品品質(zhì)，如果用含抗生素的奶做酸奶或乳酪等，則殘留在其中的抗生素會抑制細菌的發(fā)酵，使產(chǎn)量和質(zhì)量降低。

抗生素殘留檢測方法的研究進展

目前抗生素殘留檢測的方法很多，基本上可以分為四大類型：一是經(jīng)典的微生物檢測方法；二是現(xiàn)代儀器分析方法；三是生化免疫分析法；四是專一試劑盒法。

1經(jīng)典微生物檢測法

其測定原理基于抗生素對微生物的生理機能、代謝的抑制作檢測用，因而與臨床應(yīng)用的要求一致，但其測定時間長且結(jié)果誤差較大。如TTC法、戴爾沃檢測（DelvotestSP）法［5］、BY法等。

1.1TTC法

TTC法是國際上較早通用的標準測定法，也是我國鮮奶中抗生素殘留量檢驗標準（GB4689.27-94）規(guī)定的檢測法。如果牛奶中含有抗生素，則加入菌種（嗜熱鏈球菌）經(jīng)培育2.5-3h后，加入TTC指示劑（三苯基四氮唑）不發(fā)生還原反應(yīng)，所以樣品呈無色狀態(tài)；如果牛奶中不含抗生素，則樣品呈紅色［6］。TTC法檢測的各種抗生素靈敏度如下：青霉素為0.004單位、鏈霉素0.5單位、慶大霉素0.4單位、卡那霉素5單位。TTC法主要對于青霉素類和氯霉素藥物敏感，但對鏈霉素不太敏感，對新霉素根本不敏感，并且消毒劑可干擾TTC試驗。TTC法檢測抗生素殘留雖然費用較低，但檢測方法消耗時間也相對較長，因此應(yīng)用受到一定限制［7］。

2戴爾沃檢測（DelvotestSP）法

是由荷蘭其試劑是由荷蘭DSM公司生產(chǎn)并由AOAC認證。原理是利用微生物——嗜熱芽胞菌在64℃條件下培養(yǎng)2.5～3h后會產(chǎn)酸，酸引起指示劑BCP(溴甲酚紫)變?yōu)辄S色；若牛奶樣品中不含抗生素，培養(yǎng)后樣品呈黃色，如樣品中含有抗生素,嗜熱芽胞菌生長受到抑制而無法產(chǎn)酸，指示劑將不變色?？蓹z測到β-內(nèi)酰胺類抗生素在內(nèi)的更多抗生素，如磺胺類、四環(huán)素類等，其中對青霉素和磺胺類抗生素特別靈敏［8］。DelvotestSP法操作方便，嚴格實用，容易判斷，結(jié)果可靠，費用適中等優(yōu)點；但也易出現(xiàn)假陽性，此方法適用于農(nóng)場、企業(yè)、實驗室及政府監(jiān)測部門。

2.1BY法

BY法，也稱藍黃檢測法，是一種廣譜的微生物抑制法，能在較短的時間里檢測到乳制品中抗生素的殘留，通過顏色的對比判斷陽性、陰性和可疑樣品。B?Linage等通過這種方法對β-內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類等25種抗生素進行了檢測，其殘留的檢測限與歐盟規(guī)定的檢測限很接近［9］。此方法耗時短，操從簡單，檢測抗生素種類較多，但誤差較大，容易誤檢。

3現(xiàn)代儀器分析方法

是利用抗生素分子中的基團所具有的特殊反應(yīng)或理化特性，借助現(xiàn)代儀器對抗生素殘留進行精確分析的一種方法。如色譜法、熒光法、毛細管電泳、色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等。

色譜法有氣相色譜（GS）、高效液相色譜（HPLC）法、反相高效液相色譜法等。檢測的過程運用了色譜理論，通過高靈敏度的檢測器，分離速度快、效率高和操作自動化。一般要經(jīng)過樣品的提取、脫蛋白、離心、層析柱凈化、衍生化等步驟，能檢測抗生素的具體含量。蔡穎用反相HPLC法測定乳制品中土霉素、四環(huán)素和金霉素殘留量。檢測限為：土霉素為15.0μg/kg、四環(huán)素為20.0μg/kg、金霉素為18.0μg/kg［10］。JianWang等運用超高效液相色譜和飛行質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC/Q-TofMS)和LC/MS/MS測定牛奶中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的殘留量，其檢測限為：紅霉素40ug/kg，泰樂菌素50ug/kg，替米考星50ug/kg，能滿足各國對這六種β-內(nèi)酰胺類抗生素的最低檢出要求。3.1高效液相色譜法高效液相色譜是目前廣泛應(yīng)用的一種理化檢測方法，它引入了氣相色譜理論，在技術(shù)上采用了高壓泵，高效固定相和高靈敏度檢測器，實現(xiàn)了分離速度快、效率高和操作自動化。高效液相色譜法測定牛奶中的藥物殘留都要經(jīng)歷樣品處理（包括樣品的提取、脫蛋白、離心、層析柱凈化、衍生化等步驟）、殘留藥物的分離和殘留藥物的檢測。

樣品的提取一般使用水和酸化有機溶劑，兩者可以同時達到脫蛋白和萃取殘留的目的。加拿大HAL使用鎢酸鈉、硫酸和水從組織中提取青霉素并脫掉蛋白質(zhì)。這種方法對牛奶中的青霉素效果非常好。樣品經(jīng)提取后要進行蛋白質(zhì)沉淀。脫蛋白的常用有機溶劑有甲醇、乙腈和2-丙醇；無機酸有硫酸和鎢酸鈉，酸化乙腈（Ph4.0～4.4），以及超濾法等。Bioson等通過把青霉素萃取入水相中，在硫酸和鎢酸鈉的存在下，已能減少幾種非極性化合物的污染，得到比較干凈的水提取液。為了從生物體液和動物組織中提取青霉素殘留，Barker等提出了基體固相分散技術(shù)（MSPD），即把樣品基體與固相填料（如C18填料）混合攪拌均勻，然后把攪拌均勻的物質(zhì)填充到層析柱中，用適當?shù)娜軇┝芟瓷蠈臃治鑫铩?/p>

通常，得到的水提取液或有機提取液中，目標分析物濃度都有很低，還含有許多共萃物，如果這些物質(zhì)在最終的溶液中存在，不僅會損害色譜儀器，也會增加檢測的噪音，無法測定痕量濃度的目標分析物。為了降低背景化合物的干擾，通常需要對目標分析物進行凈化與濃縮。常用的凈化和濃縮方法有離子交換（IE）、固相萃?。⊿PE）和免疫親合色譜法（IAC）。Moats等在分析青霉素殘留時,首次嘗試驗把自動在線痕量富集的方法用于樣品凈化。這種半自動化技術(shù)使用餾分收集器收集色譜淋洗液中預(yù)先確定的餾分。把收集到的餾分濃縮后，再進行液相色譜測定。此法已用于測定牛奶中的羥氨芐青霉素，鄰氯青霉素和苯氧甲基青霉素、氨芐青霉素和羥氨芐青霉素。

殘留組分的分離方式包括正相、反相和離子交換等幾種分離手段。近幾年來大都有改用反相色譜法，最常用的分析柱填料為ODS-C18。反相HPLC具有高效、短時，并在含水系統(tǒng)中完成分析等特點。某些含有立體異構(gòu)體的藥物，如氨芐青霉素、苯氧乙基青霉素以及羧芐青霉素等，也可用離子對反相（RP）HPLC來改善其分離效果。但對強極性的青霉素類藥物，如頭孢三嗪，分離效果不甚理想。在流動相中加入離子對試劑，以改善其分離的選擇性。

青霉素藥物被分離后，最常用的檢測方式為濃度型的紫外檢測器和熒光檢測器。彭莉等[11]報道了用高效液相色譜法（HPLC）檢測牛奶中氯霉素的殘留量，采用乙酸乙酯提取牛奶中殘留的氯霉素，用正烷-氯仿（1+1，V/V）溶解殘渣，以乙腈-0.005mol/L磷酸氫二銨（18+82，V/V）作為流動相，用高效液相色譜儀紫外檢測器在278nm檢測。平均加收率94.8%，變異系數(shù)<12.0%。樣品前處理簡單、回收率高、實用性強、檢疫靈敏度高、重現(xiàn)性好、檢測數(shù)據(jù)準確可靠，可作為牛奶中氯霉素殘留檢測的確證方法。

儀器分析方法分離速度快、效率高和自動化程度高，能檢測抗生素的具體含量，敏感性較高，結(jié)果準確，但待檢樣品需經(jīng)一系列的預(yù)處理，繁瑣費時，還必須有相應(yīng)的價格昂貴的儀器設(shè)備。一般在大型實驗室使用，適合于精確測定。

3.2生化免疫法

目前應(yīng)用的生化免疫分析技術(shù)，是以抗原與抗體的特異性、可逆性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)的分析技術(shù)。其基本原理是抗原抗體的競爭性結(jié)合?？煞譃槊嘎?lián)免疫測定法（ELISA）、熒光免疫測定法(FIA)、免疫分析技術(shù)與常規(guī)理化分析技術(shù)聯(lián)用的方法等。

酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)：以待測抗原（或抗體）與酶標抗體（或抗原）的特異結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過酶活力測定來確定抗原（或抗體）含量。因為結(jié)合了免疫反應(yīng)和酶催化反應(yīng)，所以是一種特異而又敏感的技術(shù)。YONGJIN運用酶聯(lián)免疫法(ELISA)對慶大霉素的檢測限度為0.5ng/mL。Bucknal等運用免疫檢測法測定了在牛奶中幾種喹諾酮藥物的殘留量。酶聯(lián)免疫法測定，其敏感性和特異性好，檢測的靈敏度以普遍使用的β-內(nèi)酰胺類計：青霉素為5ppb，阿莫西林為10ppb，氨芐西林為10ppb，頭孢西林為8ppb[12]。其檢測結(jié)果快速準確，9分鐘內(nèi)即可檢測出牛奶中β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、磺胺類等抗生素的殘留含量，可監(jiān)控牧場用藥的情況。熒光免疫測定(FIA)法原理是應(yīng)用一對單克隆抗體的夾心法。底物用磷酸-4-甲基傘形酮，檢測產(chǎn)物發(fā)出的熒光，熒光強度與抗原抗體復(fù)合物(Mb)濃度呈正比，可在8min內(nèi)得出結(jié)果。結(jié)果以Mb每小時釋放的速率表示(△Mb)表示。Huth已經(jīng)用熒光免疫法測定了牛奶中的6種β-內(nèi)酰胺類抗生素，得到它們的最低檢測限為：青霉素G3.2μg/kg、氨芐青霉素2.9μg/kg、羥氨芐青霉素3.6μg/kg、頭孢匹林16.3μg/kg；該法重復(fù)性好，具有快速、敏感、準確的特點［13］。

生化免疫法測定抗生素殘留靈敏度極高，達到ng級水平；檢測快速、專一性強。由于此法的高度專一性，每檢測一種抗生素就要制備或購買相應(yīng)的抗原或抗體，導(dǎo)致檢測費用較高。因此生化免疫檢測法不可能取代色譜或光譜等常規(guī)分析方法，只能作為其重要的補充。

4專一試劑盒法

ECLIPSE試劑盒的原理是含有芽孢桿菌的瓊脂培養(yǎng)基和pH指示劑，當在(65±1)℃下培養(yǎng)時，孢子發(fā)育生長，降低培養(yǎng)基pH值，在pH指示劑的作用下，藍(紫)色變?yōu)榫G-黃色。生鮮牛乳中的抗生素殘留使微生物生長和酸的產(chǎn)生受到抑制，由于沒有酸生成，顏色將不會改變。

ECLIPSE試劑盒有ECLIPSE50和ECLIPSE100兩種試劑盒。ECLIPSE50的精確度雖然沒有ECLIPSE100的高，但其檢測限都符合歐盟標準，彌補了快速方法只能單一檢測某類抗生素的缺陷，同時提高了檢測的廣譜性和高靈敏度，同時也可以同歐盟等國家的先進檢測技術(shù)和標準接軌我國的牛奶事業(yè)提供非常有效和準確的抗生素殘留檢測方法［14］。操作簡單。，靈活性強，無需對樣品進行任何的處理，只需嚴格按照說明書上規(guī)定的方法進行操作，就能獲得理想的效果，且不易出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象，被檢樣品的需要量少，且費用低，越來越被廣泛應(yīng)用。

乳制品抗生素殘留的檢測方法很多，有的操作煩瑣,有的實驗條件要求高，有的檢驗時間太長；這些不僅會給乳制品生產(chǎn)企業(yè)造成經(jīng)濟上和時間上的損失，而且檢測結(jié)果常常會被原輔材料和人為操作等因素所影響。牛奶中抗生素殘留是涉及人類健康的公共衛(wèi)生問題，開發(fā)出越來越準確、快速，誤差越來越小的檢測方法，方便地檢出乳和乳制品中抗生素殘留，凈化消費環(huán)璄，就能為居民的身心健康提供保障，促進中國乳業(yè)健康發(fā)展。中國乳制品行業(yè)起步晚，起點低，但發(fā)展迅速。特別是改革開放以來，奶類生產(chǎn)量以每年兩位數(shù)的增長幅度迅速增加，遠遠高于1%的同期世界平均水平。中國乳制品產(chǎn)量和總產(chǎn)值在最近的10年內(nèi)增長了10倍以上，已逐漸吸引了世界的眼光，我國乳業(yè)資源存量和發(fā)展?jié)摿薮?，世界乳業(yè)的發(fā)展態(tài)勢表明，我國已成為全球乳業(yè)未來發(fā)展的增長點［15］。盡管2004年我國乳業(yè)遭遇了伊利折帥、蒙牛遇誹、完達山內(nèi)訌、三鹿蒙冤、三元虧損換帥，以及“倒奶”事件、阜陽“毒奶粉”事件等等，但也應(yīng)該看到意大利帕瑪拉特、法國達能、美國卡夫、英國聯(lián)合利華、荷蘭菲仕等世界乳業(yè)巨頭已先后退出中國市場［16］。我國日益注重科技創(chuàng)新帶來利潤增長，截止2004年，伊利、三元都擁有了國家級技術(shù)中心。隨著中國乳品市場的漸趨成熟，乳品企業(yè)的品牌定位日益明確，將持續(xù)拉動市場需求，乳業(yè)的發(fā)展前景依然廣闊［17］。

參考文獻［1］趙志華.淺析乳業(yè)現(xiàn)狀、潛在發(fā)展瓶頸及對策.中國乳品工

業(yè)，2004，1（32）：55-58.

［2］苑翠柳.乳品的營養(yǎng)保健與國際市場發(fā)展趨勢.山東食品科

技，2003，2：1-2.［3］宮春波，張永翠.牛初乳中的營養(yǎng)成分及其保健功能.中國奶牛，2000，6：44.

［4］李志才，王寶軍.新型乳品——多功能免疫牛乳.中國乳業(yè)，2003,4:27-29.［5］SHENGHUICUI,JINGYUNLI,CHANGQINHU,etal.DevelopmentofaMethodfortheDetectionof-LactamasesinMilkSamples［J］.CUIETAL:JOURNALOFAOACINTERNATIONAL,2007,90(4):1128-1130.

［6］盧兆蕓.乳和乳制品中抗生素殘留的危害及檢測方法［J］.中國乳品工業(yè),2006,34(11):43-45.［7］MarchettiM,SchwaigerI,SchmidER.Determinationofbenzylpenicillin,oxacillin,cloxacillin,Anddicloxacillinincows'milkbyion-pairhigh-performanceliquidchromatographyafterprecolumnderivatization［J］.FreseniusJAnalChem,2001,(371):64-67.

［8］B.Linage,C.Gonzalo,J.A.Carriedo,etcPerformanceofBlue-YellowScreeningTestforAntimicrobialDetectioninOvineMilk［J］.JournalofDairyScience2007,90(12):5374-5379.

［9］蔡穎,韓奕奕,何志軍.反相高效液相色譜法測定乳制品中土霉素、四環(huán)素和金霉素殘留量［J］.化學(xué)世界,2006,(7):398-400.

［10］J.WangandD.LeungAnalysesofmacrolideantibioticresiduesineggs,rawmilk,andhoneyusingbothultra-performanceliquidchromatography/quadrupoletime-of-flightmassspectrometryandhigh-per