第一章造血及造血調(diào)控第一節(jié)造血器官與造血微環(huán)境臨床血液學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第四章紅細(xì)胞檢驗(yàn)技術(shù)第四節(jié)紅細(xì)胞膜缺陷檢驗(yàn)紅細(xì)胞滲透脆性試驗(yàn)自身溶血試驗(yàn)及其糾正試驗(yàn)酸化甘油溶血試驗(yàn)高滲冷溶血試驗(yàn)紅細(xì)胞膜蛋白電泳分析伊紅-5-馬來(lái)酰亞胺（EMA）結(jié)合試驗(yàn)紅細(xì)胞膜蛋白基因檢測(cè)目錄重點(diǎn)提示遺傳性紅細(xì)胞膜缺陷的檢驗(yàn)項(xiàng)目各檢驗(yàn)項(xiàng)目的臨床價(jià)值一、紅細(xì)胞滲透脆性試驗(yàn)【實(shí)驗(yàn)原理】紅細(xì)胞滲透脆性試驗(yàn)(erythrocyteosmoticfragilitytest)是紅細(xì)胞在低滲鹽水中，水通過(guò)細(xì)胞膜內(nèi)滲，使細(xì)胞膜膨脹破壞而溶血。實(shí)驗(yàn)室常使用開(kāi)始溶血、完全溶血的鹽水濃度衡量紅細(xì)胞脆性，其脆性大小主要取決于紅細(xì)胞表面積與體積的比值，比值越低，紅細(xì)胞對(duì)低滲溶液的抵抗力越小（滲透脆性增加），反之，則抵抗力較高（滲透脆性降低）?！緟⒖紖^(qū)間】開(kāi)始溶血：3.8～4.6g/LNaCl溶液；完全溶血：2.8～3.2g/LNaCl溶液。（簡(jiǎn)易半定量法）本實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)紅細(xì)胞對(duì)不同濃度低滲鹽溶液抵抗力的一個(gè)半定量試驗(yàn)。

正常人試驗(yàn)結(jié)果遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥患者脆性升高一、紅細(xì)胞滲透脆性試驗(yàn)【臨床意義】增高主要見(jiàn)于遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥、遺傳性橢圓形紅細(xì)胞增多癥、部分自身免疫性溶血性貧血、遺傳性口型紅細(xì)胞增多癥及Ⅱ型糖尿病等。2.減低主要見(jiàn)于珠蛋白生成障礙性貧血、血紅蛋白C、D、E病，低色素性貧血、阻塞性黃疸、脾切除術(shù)后、肝炎、肝硬化、肝癌等。某些中藥（如當(dāng)歸）、磁場(chǎng)、紫外線亦可降低紅細(xì)胞滲透脆性。一、紅細(xì)胞滲透脆性試驗(yàn)12345678910080604020%LysisNaClg/L鐮狀細(xì)胞貧血重型-珠蛋白生成障礙性貧血遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥自身免疫性溶血性貧血正常范圍一、紅細(xì)胞滲透脆性試驗(yàn)【應(yīng)用評(píng)價(jià)】

本試驗(yàn)簡(jiǎn)便實(shí)用，但敏感性較差，對(duì)溶血性貧血的病因診斷有參考價(jià)值，但需結(jié)合其他檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行綜合分析。2.紅細(xì)胞膜異常較輕微的病例應(yīng)做紅細(xì)胞孵育滲透脆性試驗(yàn)。將紅細(xì)胞先置于37℃孵育24小時(shí)，使紅細(xì)胞葡萄糖消耗，ATP儲(chǔ)備減少，紅細(xì)胞膜對(duì)陽(yáng)離子的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)受阻，陽(yáng)離子在細(xì)胞內(nèi)蓄積，細(xì)胞膨脹，脆性增加后，再進(jìn)行相應(yīng)的滲透脆性試驗(yàn)（以50%溶血率的鹽水濃度表示）。3.此法也可用于丙酮酸激酶缺陷癥（pyruvatekinasedeficiency，PKD）等紅細(xì)胞酶缺陷性溶血的診斷。一、紅細(xì)胞滲透脆性試驗(yàn)二、自身溶血試驗(yàn)及其糾正試驗(yàn)【實(shí)驗(yàn)原理】自身溶血試驗(yàn)及其糾正試驗(yàn)(autohemolysis&correctingtest)是測(cè)定患者血液在37℃孵育48h后，自發(fā)產(chǎn)生溶血的程度。紅細(xì)胞在孵育期間，由于膜異常引起Na+內(nèi)流明顯增加，ATP消耗過(guò)多，或由于糖酵解途徑酶缺陷所引起ATP生成不足等原因，導(dǎo)致ATP儲(chǔ)備量減少，鈉泵功能減弱，Na+和水在細(xì)胞內(nèi)蓄積，紅細(xì)胞膨脹、破裂溶血。在孵育時(shí)，加入葡萄糖或ATP作為糾正物，觀察溶血能否被糾正，為自身溶血試驗(yàn)的糾正試驗(yàn)。【參考區(qū)間】健康人紅細(xì)胞在無(wú)菌條件下孵育48小時(shí)，不加糾正物的溶血率一般＜4.0%，加葡萄糖的溶血率＜0.6%，加ATP糾正物的溶血率＜0.8%。（分光光度法）【臨床意義】

1.遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥自身溶血率增加，能被葡萄糖或ATP糾正；2.葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G-6-PD）缺乏癥等戊糖旁路代謝缺陷的患者自身溶血率增加，能被葡萄糖糾正；3.PK缺乏癥時(shí)，不能利用葡萄糖產(chǎn)生ATP，其自身溶血率明顯增加，不能被葡萄糖糾正，但能被ATP糾正；4.獲得性溶血性貧血如PNH、自身免疫性溶血性貧血及藥物性溶血等加葡萄糖后效果不定，但是加ATP可明顯糾正?！緫?yīng)用評(píng)價(jià)】

本試驗(yàn)不夠敏感和特異，僅對(duì)遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥有一定診斷價(jià)值，有助于溶血性貧血的鑒別診斷，但不能作為確診試驗(yàn)。二、自身溶血試驗(yàn)及其糾正試驗(yàn)三、酸化甘油溶血試驗(yàn)【實(shí)驗(yàn)原理】

(acidifiedglycerinhemolysistest，AGLT)是當(dāng)甘油存在于氯化鈉磷酸緩沖液的低滲溶液時(shí)，可阻止低滲溶液中的水快速進(jìn)入紅細(xì)胞內(nèi)，減慢溶血過(guò)程。但甘油與膜脂質(zhì)又有親和性，可使膜脂質(zhì)減少，促進(jìn)紅細(xì)胞溶血。檢測(cè)時(shí)，吸光度隨溶血的增加而下降。當(dāng)紅細(xì)胞膜蛋白或膜脂質(zhì)有缺陷時(shí)，它們?cè)趐H6.85的甘油緩沖液中較正常紅細(xì)胞溶解速度快，導(dǎo)致紅細(xì)胞懸液的吸光度下降至起始吸光度一半時(shí)所需的時(shí)間（AGLT50）明顯縮短。通常測(cè)定AGLT50反映紅細(xì)胞膜是否有缺陷?！緟⒖紖^(qū)間】

健康人AGLT50＞290秒。（分光光度法）【臨床意義】

1.遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥AGLT50可明顯縮短（25～150秒），自身免疫性溶血性貧血、腎功能衰竭、妊娠等AGLT50也可縮短；2.HbH紅細(xì)胞溶解明顯減少，與缺鐵性貧血不同，可作為初篩試驗(yàn)?！緫?yīng)用評(píng)價(jià)】

1.本試驗(yàn)對(duì)遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥診斷的敏感性和特異性較高，也是進(jìn)行家系調(diào)查的較理想方法。2.該試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，但應(yīng)準(zhǔn)確配制所用試劑和嚴(yán)格控制試驗(yàn)溫度，以保證結(jié)果的可靠性。三、酸化甘油溶血試驗(yàn)四、高滲冷溶血試驗(yàn)【實(shí)驗(yàn)原理】在高滲狀態(tài)下，溫度驟然變化影響紅細(xì)胞膜脂質(zhì)的流動(dòng)性，并可能累及膜磷脂與膜骨架蛋白結(jié)合位點(diǎn)，紅細(xì)胞容易破裂而發(fā)生溶血。當(dāng)膜蛋白缺陷致膜表面積與體積比值降低，溶血率明顯增加；反之，溶血率降低。本試驗(yàn)是測(cè)定紅細(xì)胞在不同濃度高滲緩沖液中，從37℃水浴立即置于0℃水浴一定時(shí)間的最大溶血率?！緟⒖紖^(qū)間】

9mmol/L或12mmol/L蔗糖：最大溶血率66.5%～74.1%；7mmol/L蔗糖：最大溶血率0.1%～16.9%。（分光光度法）【臨床意義】

1.溶血率增加見(jiàn)于遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥；2.溶血率降低見(jiàn)于珠蛋白生成障礙性貧血和異常血紅蛋白病；3.自身免疫性溶血性貧血基本正常。【應(yīng)用評(píng)價(jià)】

本試驗(yàn)簡(jiǎn)便、易行，無(wú)需特殊試劑和儀器，是遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥的篩檢試驗(yàn)之一。四、高滲冷溶血試驗(yàn)五、紅細(xì)胞膜蛋白電泳分析【實(shí)驗(yàn)原理】在4℃條件下，用低滲方法破壞紅細(xì)胞，制備無(wú)細(xì)胞內(nèi)容物的紅細(xì)胞膜樣品。將制備的紅細(xì)胞膜樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis,SDS），SDS與紅細(xì)胞膜蛋白混合加熱至100℃時(shí)，能使所有肽鏈之間的連接完全解離，同時(shí)肽鏈與SDS結(jié)合，形成SDS多肽復(fù)合物。以PAGE為載體，在電場(chǎng)作用下，膜蛋白能分離出各種區(qū)帶。根據(jù)樣品中各蛋白相對(duì)分子質(zhì)量的不同，分離得到紅細(xì)胞膜蛋白的電泳圖譜，從而求得各膜蛋白組分百分率。五、紅細(xì)胞膜蛋白電泳分析【參考區(qū)間】正常人紅細(xì)胞膜蛋白經(jīng)SDS電泳后依次出現(xiàn)下列主要區(qū)帶：區(qū)帶1、2（收縮蛋白）、區(qū)帶2.1（錨蛋白）、區(qū)帶3（陰離子通道）、區(qū)帶4.1、區(qū)帶4.2、區(qū)帶4.5（葡萄糖運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白）、區(qū)帶4.9、區(qū)帶5（肌動(dòng)蛋白）、區(qū)帶6（3-磷酸甘油醛脫氫酶）和區(qū)帶7等。由于各實(shí)驗(yàn)室采用的電泳條件不同，紅細(xì)胞各種膜蛋白組分百分率變化較大，多與正常紅細(xì)胞膜蛋白電泳圖譜作比較。或以帶3蛋白為基準(zhǔn)，以各膜蛋白含量與帶3蛋白的比例表示。各實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)自己的條件制定參考區(qū)間（SDS法）。五、紅細(xì)胞膜蛋白電泳分析【臨床意義】

許多先天性和后天性溶血性貧血都伴有紅細(xì)胞膜蛋白異常，可檢出收縮蛋白等含量減低或結(jié)構(gòu)異常。80%以上遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥患者有膜蛋白缺陷，包括膜收縮蛋白單獨(dú)缺乏、錨蛋白與收縮蛋白聯(lián)合缺乏、區(qū)帶3蛋白缺乏、區(qū)帶4.1、4.2蛋白缺乏等；3.遺傳性橢圓形紅細(xì)胞增多癥患者可存在收縮蛋白或區(qū)帶4.1蛋白缺陷；4.某些血紅蛋白病和PNH等亦可有骨架蛋白明顯異常；肝病也可有紅細(xì)胞膜蛋白異常。紅細(xì)胞各種膜蛋白組分百分率變化較大，實(shí)驗(yàn)室多與正常紅細(xì)胞膜蛋白電泳圖譜作比較；或以帶3蛋白為基準(zhǔn)，以各膜蛋白含量與帶3蛋白的比例表示。α收縮蛋白β收縮蛋白錨蛋白帶3蛋白區(qū)帶4.1區(qū)帶4.2肌動(dòng)蛋白（區(qū)帶5）G3PD（區(qū)帶6）區(qū)帶7kd2501501007550正常人紅細(xì)胞膜蛋白經(jīng)SDS電泳結(jié)果圖五、紅細(xì)胞膜蛋白電泳分析五、紅細(xì)胞膜蛋白電泳分析【應(yīng)用評(píng)價(jià)】

本試驗(yàn)可直接反映紅細(xì)胞膜蛋白的缺陷，有助于溶血性貧血病因分析，為紅細(xì)胞膜缺陷性疾病診斷提供重要依據(jù)。2.由于SDS測(cè)定膜蛋白結(jié)果不夠精確，尤其是用于測(cè)定量少的蛋白如錨蛋白等，結(jié)果更是不夠理想，所以大多局限于定性或半定量的研究。目前臨床上更多采用放射免疫法或ELISA法直接測(cè)定每個(gè)紅細(xì)胞的膜蛋白含量。六、伊紅-5-馬來(lái)酰亞胺（EMA）結(jié)合試驗(yàn)【實(shí)驗(yàn)原理】熒光染料伊紅-5-馬來(lái)酰亞胺（EMA）可以與紅細(xì)胞膜帶3蛋白第一個(gè)細(xì)胞外環(huán)上的Lys430形成共價(jià)鍵結(jié)合，在519nm吸收光，540nm放射光。帶3蛋白結(jié)合了EMA后，其陰離子交換特性被部分抑制從而引起結(jié)構(gòu)的改變。用EMA標(biāo)記紅細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)可測(cè)定其平均通道熒光強(qiáng)度（MCF）。【參考區(qū)間】由于不同實(shí)驗(yàn)室報(bào)道的MCF參考區(qū)間存在顯著差異，故每個(gè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)確定自己的參考區(qū)間。往往一份待測(cè)標(biāo)本需與六份正常標(biāo)本進(jìn)行比對(duì)（流式細(xì)胞術(shù)）。熒光信號(hào)降低也可見(jiàn)于遺傳性熱異形紅細(xì)胞增多癥（HPP）、先天性紅細(xì)胞生成異常性貧血II型（CDA-II）、東南亞卵圓形紅細(xì)胞增多癥等。

EMA標(biāo)記紅細(xì)胞熒光柱形圖六、伊紅-5-馬來(lái)酰亞胺（EMA）結(jié)合試驗(yàn)六、伊紅-5-馬來(lái)酰亞胺（EMA）結(jié)合試驗(yàn)【臨床意義】EMA結(jié)合試驗(yàn)可作為遺傳性紅細(xì)胞膜缺陷性疾病的篩查方法，可以將遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥、遺傳性橢圓形紅細(xì)胞增多癥與其他溶血性疾病進(jìn)行鑒別（如G-6-PD缺乏癥、血紅蛋白病及自身免疫性溶血性貧血），前者M(jìn)CF值明顯低于正常人（為正常人的65%左右）及其他溶血性疾病?！緫?yīng)用評(píng)價(jià)】該法目前被認(rèn)為是快速篩查遺傳性紅細(xì)胞膜缺陷性溶血性貧血尤其是遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥的方法。該方法特異性不強(qiáng)，且標(biāo)本必須快速處理，因?yàn)榇娣趴捎绊懺囼?yàn)結(jié)果。七、紅細(xì)胞膜蛋白基因檢測(cè)【實(shí)驗(yàn)原理】采用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性或串聯(lián)重復(fù)序列分析可確