高二生物血紅蛋白的提取和分離第一頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二課標領航1．概述凝膠色譜法、電泳法等分離大分子的基本原理。2．能根據凝膠色譜過程中的現象和結果，評價實驗操作的過程是否規(guī)范，分析實驗結果。3．嘗試對血液中血紅蛋白的提取和分離，體驗從復雜的體系中提取生物大分子的基本過程和方法?！局攸c】凝膠色譜法、電泳法基本原理?！倦y點】實驗操作的過程及分析。第二頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二課題背景為年老多病的人注射丙種球蛋白，可以在一定程度上增強其身體的抵抗力。在動物體內，丙種球蛋白和許多蛋白質混合在一起。要獲得純凈的丙種球蛋白制品，就必須進行提取和分離。電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質的差異以及分子本身的大小、形狀的不同，使帶電分子產生不同的遷移速度，從而實現了樣品中各種分子的分離。第三頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二基礎自主梳理一、凝膠色譜法1．依據2．概念3．原理★4．結合P64下面和P65上面，畫出分離方法的表格★5．注意事項二、緩沖溶液1．作用2．配制3．意義三、電泳1．概念2．原理3．作用過程4．方法第四頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二核心要點突破要點一解讀實驗原理1．蛋白質分子在凝膠中的運動情況分析相對分子質量大相對分子質量小直徑大小大于凝膠顆粒空隙直徑小于凝膠顆?？障吨睆竭\動方式垂直向下運動無規(guī)則的擴散運動運動速度較快較慢運動路程較短較長洗脫次序先從凝膠柱中洗脫出來后從凝柱中洗脫出來第五頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二第六頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二要點二第七頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二四、實驗操作原則：依據每一種蛋白質的來源和性質血液、紅細胞、血紅蛋白的組成1．樣品處理：

(1)紅細胞的洗滌--------離心去除血清(2)血紅蛋白的釋放--------蒸餾水漲破(3)分離血紅蛋白溶液--------離心處理第八頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二思考感悟

1．洗滌紅細胞時為什么不能用蒸餾水代替生理鹽水？【提示】生理鹽水能保持紅細胞的滲透壓穩(wěn)定而不至于破裂。在未洗凈血漿中的雜質蛋白前，紅細胞如果提前破裂，就可能使血紅蛋白與雜質血漿蛋白混在一起，加大了分離的難度。第九頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二思考感悟

2．在血紅蛋白釋放過程中，加入蒸餾水和甲苯的目的是什么？【提示】

(1)加入蒸餾水使紅細胞吸水漲破。(2)甲苯的作用主要是溶解細胞膜。細胞膜的主要成分為磷脂，易溶于甲苯等有機溶劑，加入甲苯能加速紅細胞破裂并釋放出血紅蛋白。第十頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二第十一頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二2．粗分離：即透析(1)方法

(2)目的：將樣品中相對分子質量較小的雜質除去。(3)原理：透析袋能使小分子自由進出，而將大分子物質保留在袋內。第十二頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二3．純化：通過凝膠色譜柱將相對分子質量較大的雜質蛋白除去。操作如下：(1)凝膠色譜柱的制作①取長40cm，內徑為1.6cm的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安裝移液管頭部→覆蓋尼龍網，再用100目尼龍紗包好。③頂塞的制作：打孔→安裝玻璃管。④組裝：將上述三者按相應位置組裝成一個整體。⑤安裝其他附屬結構。第十三頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二特別提醒底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實尼龍網，還會導致液體殘留，蛋白質分離不徹底。第十四頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二(2)凝膠色譜柱的裝填(本實驗使用的凝膠是交聯葡聚糖凝膠)①固定：將色譜柱垂直固定在支架上

②裝填：將凝膠懸浮液一次性裝填入色譜柱內

③洗滌：用磷酸緩沖液充分洗滌平衡凝膠12h注意事項:不能有氣泡存在；不能發(fā)生洗脫液流干露出凝膠顆粒的現象。第十五頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二(3)樣品的加入和洗脫①a.準備：加樣前，打開流出口，使柱內凝膠面上的緩沖液緩慢下降到與________平齊，關閉出口。b．加樣：用吸管小心地將1mL透析后的樣品加到色譜柱的頂端，注意不要破壞凝膠面。c．加樣后：打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內.②洗脫：加入____________，打開下端出口，進行洗脫。凝膠面磷酸緩沖液第十六頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二特別提醒(1)滴加樣品時，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣，同時注意不要破壞凝膠面。(2)在蛋白質分離過程中，仔細觀察紅色區(qū)帶在洗脫過程中的移動情況。如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動，說明色譜柱制作成功。第十七頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二第十八頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二4．純度鑒定：判斷純化的蛋白質是否達到要求。在鑒定的方法中，使用最多的是SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳。五、操作提示1．紅細胞的洗滌2．色譜柱填料的處理3．凝膠色譜柱的裝填4．蛋白質的分離六、結果分析與評價第十九頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二【探規(guī)尋律】對分離效果的判斷(1)若血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整地隨洗脫液緩慢流出，則裝填成功，分離操作正確。(2)若血紅蛋白的紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，則說明分離效果不好，裝填不成功。第二十頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二【互動探究】

(1)凝膠色譜柱的裝填應注意哪些事項？(2)血紅蛋白溶液是如何分離的？【提示】

(1)①裝填前為了加速膨脹，可以加入洗脫液的濕凝膠，用沸水浴加熱，優(yōu)點是：節(jié)約時間，除去凝膠中可能帶有的微生物，排除膠粒內的空氣。②裝填時不能有氣泡，氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質的洗脫次序，降低分離效果。③裝填后不能發(fā)生洗脫液流干露出凝膠顆粒的現象。第二十一頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二(2)蛋白質的分離是根據離心原理進行的。當含有細小顆粒的懸浮液靜置不動時，由于重力場的作用使得懸浮的顆粒逐漸下沉。粒子越重，下沉越快，反之密度比液體小的粒子就會上浮。微粒在重力場下移動的速度與微粒的大小、形態(tài)和密度有關，并且又與重力場的強度及液體的黏度有關。像紅細胞大小的顆粒，直徑為數微米，就可以在通常重力作用下觀察到它們的沉降過程。第二十二頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二 (2011年聊城高二檢測)有關凝膠色譜法和電泳法的說法正確的是(

)A．它們都是分離蛋白質的重要方法B．它們的原理相同C．使用凝膠色譜法需要使用緩沖溶液而電泳不需要D．以上說法都正確【嘗試解答】

__A__例1第二十三頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二【解析】凝膠色譜法是根據相對分子質量的大小分離蛋白質的一種有效方法；電泳法是利用待測樣品中各種分子帶電性質的差異和分子本身的大小、形狀不同，使帶電分子產生不同的遷移速度，從而實現樣品中各種分子的分離。這兩種方法都用到緩沖溶液，以調節(jié)溶液的酸堿度?！菊`區(qū)警示】不同的蛋白質在凝膠色譜中有三種運動情況：(1)分子很小，可進入凝膠全部內孔隙；(2)分子很大，完全不能進入凝膠的任何內孔隙；(3)分子大小適中，能進入凝膠內孔隙中孔徑大小相應部分。第二十四頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二跟蹤訓練下列各項中，一般不影響凝膠色譜法分離蛋白質的分離度的是(

)A．層析柱