480480ChineseJournalofBiotechnology/cjbcn周傳華等/來源于葡萄球菌的N-乙酰神經(jīng)氨酸裂合酶的基因克隆及性質(zhì)April25,2013,29(4):480-489?2013ChinJBiotech,Allrightsreserved工業(yè)生物技術(shù)工業(yè)生物技術(shù)來源于葡萄球菌的N-乙酰神經(jīng)氨酸裂合酶的基因克隆及性質(zhì)2中國科學院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所工業(yè)酶國家工程實驗室，天津30周傳華,陳曦,馮進輝,等.來源于葡萄球菌N-乙酰神經(jīng)氨酸裂合酶的基因克隆及性質(zhì).生物工程學報,2013,29(4):480-489.ZhouCH,ChenX,FengJH,etal.MolecularcloningandcharacterizationofaN-acetylneuraminatelyasegenefromStaphylococcushominis.ChinJBiotech,2013,29(4):480-489.摘要:葡萄球菌Staphylococcushominis來源的N-乙酰神經(jīng)氨酸裂合酶基因shnal(GenBankAccessionNo.EFS20452.1)構(gòu)建至pET-28a質(zhì)粒并在大腸桿菌中得到表達。通過目的蛋白的純化和酶學性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，ShNAL是一個四聚體，裂解方向的最適反應pH為8.0；合成方向的最適反應pH為7.5，最適反應溫度為45℃。在45℃下孵育2h對ShNAL的活力基本無影響，高于45℃時，活力迅速下降。該酶在pH5.0~10.0的環(huán)境中比較穩(wěn)定，4℃下放置24h酶的殘余活力在70％以上。ShNAL對N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)、N-乙酰甘露糖胺(Man)和丙酮酸(Pyr)的Km值分別是(4.0±0.2)mmol/L、(131.7±12.1)mmol/L和(35.1±3.2)mmol/L，kcat/Km值分別為1.9L/(mmol·s)、0.08L/(mmol·s)和0.08L/(mmol·s)。關(guān)鍵詞:葡萄球菌，N-乙酰神經(jīng)氨酸裂合酶，表達，純化，生物催化Received:September19,2012;Accepted:November30,2012Supportedby:NationalBasicResearchProgramofChina(973Program)(No.2011CB710801).Correspondingauthor:QiaqingWu.Tel/Fax:+86-22-84861963;E-mail:wu_qq@DunmingZhu.Tel/Fax:+86-22-86841962;E-mail:zhu_dm@國家重點基礎研究發(fā)展計劃(973計劃)(No.2011CB710801)資助。481周傳華等/來源于葡萄球菌的N-乙酰神經(jīng)氨酸裂合酶的基因克隆及性質(zhì)481MolecularcloningandcharacterizationofaN-acetylneuraminatelyasegenefroChuanhuaZhou1,2,XiChen2,JinhuiFeng2,DongguangXiao1,QiaqingWu2,2NationalEngineeringLaboratoryforIndustrialEnzymes,TianjinInstituteofIndustrialBiotechnology,ChineseAcademyofSciences,Abstract:AN-acetylneuraminatelyasegene(shnal)fromStaphylococcushominiswasclonedintopET-28aandexpressedinEscherichiacoliBL21(DE3)hostcells.Therecombinantenzymewaspurifiedandcharacterized.ItisahomotetramericenzymewiththeoptimumpHat8.0forthecleavagedirectionandtheoptimumpHandtemperaturewere7.5and45°Cforthesyntheticdirection.TheactivityofShNALisstablewhenincubatedat45°Cfor2hbutdecreasedrapidlyover50°C.ShNALshowedhighstabilityinawiderangepHfrom5.0to10.0withtheresidualactivitybeing>70%whentheenzymewasincubatedindifferentbuffersat4°Cfor24h.ItsKmtowardsN-acetylneuraminicacid,pyruvateandManNAcwere(4.0±0.2)mmol/L,(35.1±3.2)mmol/Land(131.7±12.1)mmol/L,respectively.Thekcat/KmvalueofNeu5Ac,ManNAc,andPyrforShNALwere1.9L/(mmol·s),0.08L/(mmol·s)and0.08L/(mmol·s),respectively.Keywords:Staphylococcushominis,N-acetylneuraminatelyase,expression,purification,bi羥醛縮合反應是指含有活性“氫原子的化合羰基化合物發(fā)生親核加成，得到β-羥基醛酮或酸。羥醛縮合反應形成新的碳-碳鍵，是有機合成中極為重要的一類反應[1]。目前實現(xiàn)不對稱羥醛縮合反應的化學方法主要有添加手性助劑[2]或用手性路易斯酸[3]、有機小分子[4-6]等進行催化。相對于化學催化法，應用生物催化劑實現(xiàn)羥醛縮合反應具有反應條件溫和、綠色無污染、底物立體選擇性強等優(yōu)點，在工業(yè)上具有良好的應用前景。N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)是某些復合糖抗菌等多方面有生物學活性，是合成抗病毒試劑扎那米韋(Zanamivir)的重要中間體[7]，在生物N-乙酰神經(jīng)氨酸裂合酶(N-Acetyl-D-neuraminicacidlyase，EC簡稱NAL)是裂合酶酶既可以將N-乙酰神經(jīng)氨酸(簡稱Neu5Ac)裂解成N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)和丙酮酸(Pyr)，又能催化ManNAc和Pyr羥醛縮合生成N-乙酰神經(jīng)氨酸[8](圖1)。NAL在微生物界的分布非常廣泛，多種微生物中都曾檢測到該酶的活性[9-11]，其中來源于大腸桿菌Escherichiacoli[12Clostridiumperfringens[15]、嗜血桿菌屬Haemophilusinfluenza[16]、Trichomonasvaginalis[17]、巴氏桿菌屬Pasteurellamultocida[18]和乳桿菌屬Lactobacillusplantarum[19]的N-乙酰神經(jīng)氨酸裂合酶基因已經(jīng)cjb@482ISSN1000-3061CN11-1998/QChinJBiotechApril25,2013Vol.29No.4482HONHAcHOHOManNAcOHNALOHpyuvateOHOHHOOHHOCOOHHOCOOHACHNHONeu5Ac圖1酶法合成Neu5Ac的圖示[8]Fig.1EnzymaticsynthesisofN-acetylneuraminicacid(Neu5Ac)fromN-acetyl-D-mannosamine(ManNAc)andpyruvate(Pyr)catalyzedbyN-acetylneuraminatelyase(NAL)[8].是通過乳酸氧化酶全細胞催化將乳酸轉(zhuǎn)化成丙生物催化合成Neu5Ac的反應中，最為關(guān)鍵的是更有利于合成反應的N-乙酰神經(jīng)氨酸裂合酶，可以更高效地合成Neu5Ac，我們通過基因挖礦選擇了幾個不同來源的基因作為研究對象，經(jīng)過初步的研究發(fā)現(xiàn)來源于葡萄球菌Staphylococcushominis的N-乙酰神經(jīng)氨酸裂合酶的活性較高，對該酶的性質(zhì)進行了較詳細的研究。1.1材料1.1.1菌株和質(zhì)粒菌株E.coliTrans5“由本實驗室保存，pET28a(+)載體和E.coliBL21(DE3)均購自Novagen公司。通過基因挖礦獲得候選基因，序列信息來源于NCBI數(shù)據(jù)庫(GenBankAccessionNo.EFS20452.1)，全基因序列由上海旭冠生物科技發(fā)展有限公司合成。BCA蛋白濃度試劑盒購自康為世紀公司酸和乳酸脫氫酶(LDH)購自Sigma公司；考馬內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ以及T4DNA連接酶均購1.2序列分析(CLUSTAL-W)完成，對蛋白的理化性質(zhì)初步預測通過網(wǎng)站進行(/admin/users/login)。1.3工程菌的構(gòu)建基因的誘導表達等實驗操作均按照《分子克隆實驗指南》[21]進行。DNA膠回收按照膠回收試劑盒(Tiangen公司)說明書進行。目的基因shnal構(gòu)建至pET-28a質(zhì)粒的NdeⅠ和XhoⅠ兩酶切位1.4目的蛋白的表達及純化將工程菌接入800mLLB培養(yǎng)基(含終濃度異丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導表達4~6h。菌液6000r/min離心10min，生理鹽水/cjbcn483周傳華等/來源于葡萄球菌的N-乙酰神經(jīng)氨酸裂合酶的基因克隆及性質(zhì)483將細胞重懸到100mL含5％甘油，500mmol/LNaCl的Tr12000r/min、4℃離心30上清用0.45μm的濾膜過濾后通過蛋白純化儀(Purifier10，GE公司)在室溫下用鎳柱純化(填緩沖液(20mmol/L，pH8.0)線性洗脫目的蛋定，牛血清白蛋白BSA作為標準蛋白。ShNAL在溶液中的聚集狀態(tài)通過凝膠層析以及SDS來進行確定。所用層析柱為Superdex20010/300GL，Gelfiltrationcalibrationkit(GE)用于標準分子量測定。流動相為含150mmol/LNaCl的20mmol/L磷酸緩沖液(pH7.2)，流速為0.4mL/min。蛋白的分子量大小通過和標準蛋白的保留體積標準曲線進行比(43.0kDa)，Conalbumin(75.0kDa)，Conalbumin(158.0kDa)，F(xiàn)erritin(440.0kDa)，Thyroglobulin(669.0kDa)。1.5活性的測定1.5.1裂解方向裂解方向的活性通過酶標儀(SpectraMax是：N-乙酰神經(jīng)氨酸裂解生成的丙酮酸能在NADH和乳酸脫氫酶存在的條件下被還原成乳酸，過程中消耗了NADH，引起340nm波長下對NADH的吸光度的下降[22-23]。一個酶活力單的Neu5Ac生成1μmol的N-乙酰-D丙酮酸所需酶的量。反應體系包括10mmol/L0.85μgShNAL，反應在常溫下不同pH的100mmol/L的緩沖液中進行。1.5.2合成方向合成方向的活性通過HPLC測定，其原理為：僅加入ManNAc、Pyr和酶，通過HPLC檢1μmolNeu5Ac所需要的酶量。反應體系包括1.6酶的性質(zhì)分析合成和裂解方向的最適反應pH測定是在沖體系選用醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH4.0~6.0)，磷酸鹽緩沖液(pH6.0~8.0)，Tris-HCl緩沖液(pH8.0~9.0)，碳酸鹽緩沖液(pH9.0~11.0)，裂解方向的反應溫度為室溫，合成方向的反應溫度的測定是將反應放入20℃~65℃的環(huán)境中進行1.7酶的穩(wěn)定性研究和動力學參數(shù)測定溫度耐受性測定是將酶稀釋到pH7.0的cjb@484ISSN1000-3061CN11-1998/QChinJBiotechApril25,2013Vol.29No.448424h，測定裂解方向的殘留活性。Neu5Ac濃度下的活性，反應在pH8.0的緩沖液中進行。在合成方向，反應在pH7.5的緩沖液N-乙酰甘露糖胺的濃度為30mmol/L，測定不同Pyr濃度下酶的活力；測定N-乙酰甘露糖胺的定N-乙酰甘露糖胺不同濃度下的酶活。1.8HPLC分析條件生產(chǎn)的型號為AminexHPX-87H糖分析柱1.9合成產(chǎn)物的分離和鑒定20mL的Tris-HCl(100mmo200r/min條件下反應20h，通過離心除去菌體，100℃加熱除去蛋白終止反應。反應的轉(zhuǎn)化率通過陰離子交換樹脂(201×7)分離方法[20]純化。2.1氨基酸序列分析將來源于Staphylococcushominis與其他菌屬來源的N-乙酰胺神經(jīng)氨酸裂合酶氨基酸序列進行比較(圖2)，發(fā)現(xiàn)ShNAL與已知的N-乙酰胺神經(jīng)氨酸裂合酶，與來源于Haemophilusinfluenza[16]、Clostridiumperfringens[15]、Trichomonasvaginalis[17]和Lactobacillusplantarum[19](GenBankAccessionNo.分別是10102030405060708090100shNAL1LPNALCPNAL1TrNALECNAL1110120130140150160170180190200shNAL77LPNAL75CPNAL73TrNAL101HiNAL76ECNAL76210220230240250260270280290300shNAL76310320shNAL274LPNAL272CPNAL270TNAL299HiNAL274ECNAL275LPNAL74CPNAL172TrNAL200HiNAL175ECNAL176HiNAL圖2ShNAL與已知的N-乙酰神經(jīng)氨酸裂合酶序列的比對結(jié)果Fig.2MultiplesequencealignmentforShNALandrelatedN-acetylneuraminatelyases./cjbcn485周傳華等/來源于葡萄球菌的N-乙酰神經(jīng)氨酸裂合酶的基因克隆及性質(zhì)485P44539.1，Q9S4K9.2，AABNP_786769.1)的同源性分別為58％、56％、53％和50％，而與來源于Escherichiacoli[11]ShNAL擁有NAL亞家族活性位點的關(guān)鍵殘基酸位點編號，下同)位點、保守的GxxGE底物專一性結(jié)合框架(第47~51個氨基酸)以及兩個氨基酸位點(48、49位)是S/S，這兩個連續(xù)的氨基酸與Y137和水分子共同參與形成丙酮合位點。保守區(qū)域外的位點有較大差異。2.2重組酶的純化通過鎳柱親和層析一步純化得到電泳純的裂解方向的比活達到了24.8U/mg(表1)，在3.1U/mg。用膠過濾層析測定ShNAL的確定分子量為125kDa，其單體分子量為33.8kDa，因此該酶在溶液中以四聚體形式存在。2.3酶的最適反應pH和溫度降到最高時的17.5％(圖4)。合成方向的最適反pH9.0的碳酸鹽緩沖液中該酶仍然能保持最高活力的95％以上(圖5)。通過對ShNAL合成方向的最適反應溫度研究發(fā)現(xiàn)，在20℃~45℃之最大活力，當溫度超過50℃時酶活迅速下降(圖6)。溫度對裂解方向酶活性影響的研究表明圖3SDS分析ShNAL的純化Fig.3SDSanalysisofthepurifiedShNAL.1:proteinmarker;2:cell-freeextractwithoutinduction3:crudecell-freeextract;4:purifiedShNAL.表1ShNAL蛋白純化表Table1PurificationofShNALPurificationPurificationstep Specificactivity(U/mg) PurificationfactorCrudecell-freeextract957.74.4His-trapaffinitychromatography24.8cjb@486ISSN1000-3061CN11-1998/QChinJBiotechApril25,2013Vol.29No.4486圖4pH對裂解方向酶活性的影響Fig.4EffectofpHonShNALactivityforthecleavagedirection.Aceticacidbuffer(pH4.0to6.0),phosphatebuffer(pH6.0to8.0)andTris-HClbuffer(pH8.0to9.0)wereused.圖5pH對合成方向酶活性的影響Fig.5EffectofpHonShNALactivityforthesyntheticdirection.Acetatebuffer(pH4.0to6.0),phosphatebuffer(pH6.0to8.0),Tris-HClbuffer(pH8.0to9.0)andcarbonatebuffer(9.0to10.0)wereused.升高而不斷提高。2.4酶的穩(wěn)定性通過測定裂解反應活性變化來研究ShNALpH5.0~10.0范圍內(nèi)ShNAL的殘留活性能保持堿環(huán)境都能使酶失活(圖7)。通過測定裂解方向活性損失對ShNAL的熱圖6溫度對合成反應酶活性的影響Fig.6EffectoftemperatureonShNALactivityforsyntheticreaction.圖7pH的耐受性測定Fig.7pHstabilityofShNAL.Acetatebuffer(pH5.0to6.0),phosphatebuffer(pH6.0to8.0),Tris-HClbuffer(pH8.0to9.0)andcarbonatebuffer(pH9.0to11.0)wereused./cjbcn487周傳華等/來源于葡萄球菌的N-乙酰神經(jīng)氨酸裂合酶的基因克隆及性質(zhì)487沒有下降，說明酶在30℃的穩(wěn)定性良好，而當2.5動力學參數(shù)的測定測定合成和裂解兩個方向的動力學參數(shù)，裂解方向的Neu5Ac的Km值為(4.0±0.2)mmol/L，合成方向的ManNAc和Pyr的Km值分別為(131.7±12.1)mmol/L和(35.1±3.2)mmol/L。Neu5Ac、Pyr和ManNAc的kcat/Km值分別為Neu5Ac、Pyr的Km值與目前報道的來源于其他菌屬的N-乙酰神經(jīng)氨酸裂合酶相差不大，ManNAc的Km值比其他來源的酶都要小。ShNAL與之前研究的動力學相關(guān)參數(shù)比較見表的相關(guān)酶要低，而合成方向的催化效率kcat/Km與它們相當，可能更有利于合成反應進行。2.6合成產(chǎn)物的分離和鑒定通過HPLC檢測反應轉(zhuǎn)化率為91.5%,Neu5Ac的產(chǎn)率達到了89.4％(圖9)。反應液經(jīng)圖8溫度耐受性研究Fig.8ThermalstabilityofShNAL.Enzymewasincubatedatcertaintemperatureandmaintainforthreedifferenttimes.Activityofenzymestoredin4°Cwassetas100%relativeactivity.表2ShNAL與之前報道的不同來源的酶的動力學參數(shù)比較[18-19]Table2KineticparametersofrecombinantShNALandotherpreviouslydescribedEnzymesEnzymesActivitiesSubstratesKm(mmol/L) kcat/Km(L/(mmol·s))LpNALCleavageNeu5AcsynthesisCleavageNeu5AcManNAcPyruvateNeu5Ac2.5±0.30.030.114.00 EcNALNeu5AcsynthesisCleavageManNAcPyruvateNeu5Ac22.0±1.04.9±0.70.050.08 PmNALNeu5AcsynthesisCleavageManNAcPyruvateNeu5Ac220.0±30.023.0±1.04.0±0.20.050.08Neu5AcsynthesisManNAcPyruvate35.1±3.20.080.08cjb@488ISSN1000-3061CN11-1998/QChinJBiotechApril25,2013Vol.29No.4488圖9Neu5Ac的HPLC圖譜(A：NeuAc標準樣品；B：ShNAL催化的反應；C：NeuAc標樣和反應物的混合物)Fig.9HPLCfingerprintspectrumofNeu5Ac.(A)NeuAcstandardsample.(B)Reactionsystem.(C)MixtureofNeu5Acstandardsampleandthereactant.處理上樣0~0.2mol/L甲酸洗脫的樣品通過減壓譜檢測結(jié)果：MS(ES-)計算值C11H19NO9(308.10，實驗值307.82。目前，國內(nèi)還沒有利用分離純化的N-乙酰神經(jīng)氨酸裂合酶合成Neu5Ac的工業(yè)化生產(chǎn)的報道，限制Neu5Ac工業(yè)化生產(chǎn)的因素很多，如生產(chǎn)原料ManNAc非常昂貴外，醛縮酶(或裂解酶)的活性低等也是重要的原因。有效的解決途徑可能是通過異構(gòu)酶將相對廉價的N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)化成ManNAc，再在高活性的N-乙酰神經(jīng)氨酸裂合酶催化下來合成Neu5Ac。本研究克隆并表達了來自Staphylococcushominis的潛在N-乙酰神經(jīng)氨酸裂合酶基因shnal，研究了純化酶的酶學性質(zhì)和動力學參數(shù)，Km值最小，kcat/Km值為0.08L/(mmol·s)，優(yōu)于之前研究過的0.05L/(mmol·s)的最大值；在pH9.0的環(huán)境中，ShNAL在合成方向仍能保持合成反應最適pH下活力的95而裂解方向的活性降至最適pH下活力的17.5偏堿性條件更利于產(chǎn)物合成。綜合以上特點，ShNAL在合成反應中具有一定的優(yōu)勢，但是酶的催化活性有待進一REFERENCES[1]PalomoC,OiarbideM,GarciaJM.Currentprogressintheasymmetricaldoladditionreaction.ChemSocRev,2004,33(2):65-75.[2]EvansDA,BartroliJ,ShihTL.Enantioselectivealdolcondensations.2.Erythro-selectivechiralaldolcondensationsviaboronenolates.JAmChemSoc,1981,103(8):2127-2129.[3]MachajewskiTD,WongCH.Thecatalytic/cjbcn489周傳華等/來源于葡萄球菌的N-乙酰神經(jīng)氨酸裂合酶的基因克隆及性質(zhì)489asymmetricaldolreaction.AngewChemIntEdit,2000,39(8):1352-1374.[4]CórdovaA,ZouW,DziedzicP,etal.Directasymmetricintermolecularaldolreactionscatalyzedbyaminoacidsandsmallpeptides.ChemEurJ,2006,12(20):5383-5397.[5]DalkoPI,MoisanL.Inthegoldenageoforganocatalysis.AngewChemIntEdit,2004,43(39):5138-5175.[6]NotzW,TanakaF,BarbasCF.Enamine-basedorganocatalysiswithprolineanddiamines:thedevelopmentofdirectcatalyticasymmetricaldol,Mannich,Michael,andDiels-Alderreactions.AccChemRes,2004,37(8):580-591.[7]VonItzsteinM,WuWY,KokGB,etal.Rationaldesignofpotentsialidase-basedinhibitorsofinfluenzavirusreplication.Nature,1993,363(6428):418-423.[8]Groher,A.andHoelschK.MechanisticmodelforthesynthesisofN-acetylneuraminicacidusingN-acetylneuraminatelyasefromEscherichiacoliK12.JMolCatalB:Enzym,2012,83(0):1-7.[9]HeimerR,MeyerK.Studiesonsialicacidofsubmaxillarymucoid.ProcNatlAcadSciUSA,1956,42(10):728-734.[10]PopenoeEA,DrewRM,KeeL.TheactionofanenzymeofClostridiumperfringensonorosomucoid.JBiolChem,1957,228(2):673-683.[11]YoshihirU,YojiT,TsunetakeS.DistributionofN-acetylneuraminatelyaseinbacteriaanditsproductionbyEscherichiacoli.AgricBiolChem,1985,49(1):181-187.[12]AisakaK,UwajimaT.CloningandconstitutiveexpressionoftheN-acetylneuraminatelyasegeneofEscherichiacoli.ApplEnvironMicrobiol,1986,51(3):562-565.[13]OhtaY,WatanabeK,KimuraA.CompletenucleotidesequenceoftheE.coliN-acetylneuraminatelyase.NucleicAcidsRes,1985,13(24):8843-8852.[14]OhtaY,ShimosakaM,MurataK,etal.MolecularcloningoftheN-acetylneuraminatelyasegeneinEscherichiacoliK-12.ApplMicrobiolBiotechnol,1986,24(5):386-391.[15]TravingC,RoggentinP,SchauerR.Cloning,sequencingandexpressionoftheacylneuraminatelyasegenefromClostridiumperfringensA99.GlycoconjJ,1997,14(7):821-830.[16]LilleyGG,BarbosaJA,PearceLA.ExpressioninEscherichiacolioftheputativeN-acetylneuraminatelyasegene(nanA)fromHaemophilusinfluenzae:overproduction,purification,andcrystallization.ProteinExprPurif,1998,12(3):295-304.[17]MeysickKC,DimockK,GarberGE.MolecularcharacterizationandexpressionofaN-acetylneuraminatelyasegenefromTrichomonasvaginalis.MolBiochemParasitol,1996,76(1/2):289-292.[18]LiY