原位雜交技術原理及其應用原位雜交技術insituhybridization核酸分子雜交技術◆在研究DNA分子復制原理的基礎上發(fā)展起來的一種技術。兩條核苷酸單鏈片段,通過氫鍵結合,形成DNA-DNA、DNA-RNA或RNA_RNA雙鏈分子

按其作用方式可大致分為兩種:固相雜交和液相雜交液相雜交是指參加反應的兩條核酸鏈都游離在溶液中。液相分子雜交技術包括吸附雜交、發(fā)光液相雜交、液相夾心雜交和復性速率液相分子雜交等今固相雜交是將參加反應的一條核酸鏈固定在固體的支持物上(常用的有硝酸纖維素濾膜,其它如尼龍膜、乳膠顆粒和微孔板等),另條參加反應的核酸鏈游離在溶液中。固相雜交包括:◆菌落原位雜交(colonyinsituhybridization)

斑點雜交(Dotblot)、心Southern印跡雜交(Southernblot)◆northern印跡雜交(Northernblot)◆組織原位雜交(Tissueinsituhybridization)即原位雜交組織化學技術和原位雜交免疫細胞化學技術原位雜交技術的基本原理

利用核酸分子單鏈之間有互補的堿基順序,通過堿基對之間非共價鍵的形成,出現(xiàn)穩(wěn)定的雙鏈區(qū),形成雜交的雙鏈1.兩條核苷酸單鏈片段,在適宜的條件下,通過氫鍵結合,形成DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-RNA雙鍵分子2.應用帶有標記的(有放射性同位素,如3H、35S32P,熒光素、生物素、地高辛等非放射性物質)DNA或RNA片段作為核酸探針,與組織切片或細胞內待測核酸(RNA或DNA)片段進行雜交3.用放射自顯影等方法予以顯示,在光鏡或電鏡下觀察目的mRNA或DNA的存在與定位ITcGATcGc-DiNAVectoTranscriptionSPAT67T?polymerase3D79en9嗎iBiotinPAPAIGCUAGCc-RNAUCGAUCGm-RNA用原位雜交術,可在原位研究細胞合成某種多肽或蛋白質的基因表達。此方法有很高的敏感性和特異性,可進一步從分子水來探討細胞的功能表達及其調節(jié)機制。已成為當今細胞生物學、分子生物學研究的重要手段InsituhybridizationAromasgeneTheratbrainsection旁桑培養(yǎng)細胞,原位雜交組織化學技術發(fā)展1961年,Hal液相核酸雜交技術1969年,GaI|和Pardue用爪蟾核糖體基因探針與其卵母細胞雜交,確定該基因定位于卵母細胞的核仁中。1969年,Buongiorno-Nardelli和Amaldijohn利用同位素標記核酸探針進行了細胞或組織的基因定位,創(chuàng)造了原位雜交細胞或組織化學技術0rth(1970)應用引H標記的兔乳頭狀瘤病毒cRNA探針與兔乳頭狀瘤組織的冰凍切片進行雜交,首次用原位雜交檢測了病毒DNA在細胞中的定位,但當時的工作多采用冰凍組織切片或培養(yǎng)細胞,探針均采用同位素標記。由于同位素標記探針具有放射性既污染環(huán)境,又對人體有害,且受半衰期限制等缺點,科學工作者們開始探索用非放射性的標記物標記核酸探針進行原位雜交。Bauman(1981)等首先應用熒光素標記cRNA探針做原位雜交,然后用熒光顯微鏡觀察獲得成功Shroyer(1982)報道用2,4二硝基苯甲醛(DNP)標記DNA探針,使該DNA探針具有抗原性,然后用兔抗DNP的抗體來識別雜交后的探針,最后經免疫過氧化物酶的方法來定位雜交探針。這兩種方法至今仍有采用,但因敏感度不夠高,應用不夠普遍56、書不僅是生活，而且是現(xiàn)在、過去和未來文化生活的源泉?！獛旆ㄒ?/p>

57、生命不可能有兩次，但許多人連一次也不善于度過?！獏蝿P特

58、問渠哪得清如許，為有源頭活水來?！?/p>