全柱成像毛細管電泳（cIEF-WCID）:新一代毛細管電泳技術蛋白質藥物快速表征的利器全柱成像毛細管電泳（cIEF-WCID）:蛋白質藥物快速表征1報告內容報告內容2毛細管等電聚焦（CapillaryIsoelectricFocusing,cIEF）：一種根據(jù)蛋白質等電點pI不同而進行分離的技術。cIEF是蛋白質等兩性分子分析最有力的工具之一，是生物實驗室被廣泛應用的分析技術。傳統(tǒng)的cIEF的問題：需移動條帶分析速度慢(40min)分辨率下降聚焦時間不易優(yōu)化方法開發(fā)時間長重復性不佳CEInfinite:全柱成像等電聚焦系統(tǒng)毛細管等電聚焦（CapillaryIsoelect3AdvancedElectrophoresisSolutions,LtdCambridge,Ontario,CanadaCEInfiniteCEInfinite：毛細管電泳等電聚焦--全柱成像檢測技術（cIEF-WCID）AES(AdvancedElectrophoresisSolutions,Ltd.)

——專注于全柱檢測高效毛細管電泳技術（CE）的研發(fā)AdvancedElectrophoresisSolut4

CEInfinite將UV的點光源轉換為線光源均勻地分布在長度為5cm的分離柱上，整個聚焦過程大約5-10min，聚焦過程中蛋白質在分離柱內的任何變化都能通過動態(tài)檢測器（CMOS照相機）得到實時的成像檢測。CEInfinite將UV的點光源轉換為線光源5CEInfinite(10min)傳統(tǒng)cIEF(40min)離子交換(60min)GELIEF(400min)CEInfinite的優(yōu)勢省去移動過程，縮短分析時間快速分析（<10min）；保持cIEF的高分辨率；

復雜蛋白質的分離和

pI點的測定變得異常輕松；超高通量和出色的重復性；蛋白質pI點測定的黃金技術！CEInfinite傳統(tǒng)cIEF離子交換GELIE6CEInfinite的優(yōu)勢蛋白分析過程全程可視蛋白藥物的動態(tài)聚焦過程CMOS照相技術，全程成像顯示蛋白聚焦或變化過程；蛋白分離方法開發(fā)更簡單；

徹底顛覆了傳統(tǒng)電泳技術在

蛋白質表征中的定義！CEInfinite的優(yōu)勢蛋白分析過程全程可視蛋白藥物的動7CEInfinite的優(yōu)勢快速開發(fā)蛋白分離方法

快速

-5-12min聚焦時間方法優(yōu)化簡單-Ampholytes-Urea-FocusingtimeCEInfinite的優(yōu)勢快速開發(fā)蛋白分離方法

快速8

多種不同涂層的分離柱（FC/DB/PA），滿足不同蛋白的分離需求涂層均勻穩(wěn)定，壽命長久，分辨率高，重復性好多種內徑：100um、180um、200um200um內徑減少蛋白凝聚，不易發(fā)生堵塞，靈敏度更高、更快的進樣速度50次進樣的重復性200μmid100μmidpH10pH3CEInfinite的優(yōu)勢高靈敏度的毛細管柱

多種不同涂層的分離柱（FC/DB/PA），滿足不同蛋白的分9

AES公司自主研發(fā)的兩性電解質，共兩個系列，10種pH范圍HR3-10、2.5-5、5-8、6-9、8-10.5，適用于一般蛋白的分離SH3-10、2.5-5、5-8、6-9、8-10.5，適用于復雜蛋白，如融合蛋白、ADC等有效成分高、低蛋白吸附、pH梯度線性好、280nm背景吸收低。Aeslyte超高的分辨率CEInfinite的優(yōu)勢完善的兩性電解質載體Aeslyte8-10.5Servalyte9-11

AES公司自主研發(fā)的兩性電解質，共兩個系列，10種pH范10Ampholytes,cartrigecoatingandmarkerscanbecustomizedCEInfinite的優(yōu)勢-相對于市面上同種類儀器Ampholytes,cartrigecoating11CEInfinite的優(yōu)勢-相對于市面上同種類儀器Morestableauto-samplerCEInfinite的優(yōu)勢-相對于市面上同種類儀器Mor12CIEFofamonoclonalantibodywithCEInfinite1%HRpH3-10and3%HR5-8CIEFofamonoclonalantibody13CIEFofanantibodydrugconjugate(ADC)withCEInfinite

2%HRpH3-10and2%SH8-10.5CIEFofanantibodydrugconju14CIEFofafusionproteinwithSH4-8

CIEFofafusionproteinwith15CIEFofhemoglobinAFSCwithdifferentpHrangeCAsCIEFofhemoglobinAFSCwithd16SHpH4-8SHpH5.5-7CIEFoffusionproteinwithdifferentpHrangeCAsSHpH4-8SHpH5.5-7CIEFoffu17

AES公司自主研發(fā)的pI標記物，數(shù)量多達29種，pI范圍2.8-10.5小分子pI標記物，pI標示準確、穩(wěn)定性好每0.5

pH單位有一對Marker,有足夠的Marker和樣品峰盡量靠近，保證pI校正的重復性和準確性。2.8510.453.213.53.597.057.06.616.145.855.915.124.654.224.54.147.558.187.658.48.718.799.339.469.7710.17.4pI標記物CEInfinite的優(yōu)勢寬范圍覆蓋的pI標記物

AES公司自主研發(fā)的pI標記物，數(shù)量多達29種，pI范圍18報告內容報告內容19全柱成像cIEF技術作為一種創(chuàng)新的等電聚焦方法，可以應用于蛋白質或其他兩性物質等電點的測定，等電點的測定可精確至0.01個pH單位。在生物制藥廠的實驗室里，全柱成像cIEF可應用于藥物研發(fā)、細胞株篩選、生產過程分析、藥物制劑研究分析、藥物穩(wěn)定性研究以及最終產品的質量控制分析。

單克隆抗體重組蛋白疫苗等電點測定及異質性表征：CEInfinite:抗體藥物表征的利器全柱成像cIEF技術作為一種創(chuàng)新的等電聚焦方法，可20

根據(jù)蛋白質電荷特性的差異可區(qū)分鑒別蛋白，因此通過測定蛋白質的等電點，可以部分地確定蛋白質的屬性。通過對所分離的不同蛋白變異株的定量，可評估其異質性。某單克隆抗體的全柱成像cIEF結果IEF條件：蛋白濃度：0.4mg/mlCA：4%HRpH3-10電場：600V/minUrea：4mol/L聚焦時間：5min蛋白質pI測定根據(jù)蛋白質電荷特性的差異可區(qū)分鑒別蛋白，因此通過測定蛋21

在生產和純化過程中，蛋白質能表現(xiàn)出多種電荷異質性改變，這些變化不僅影響藥物的穩(wěn)定性，也影響活性，而且還可能導致有害的免疫反應。所以，開發(fā)和生產過程中蛋白藥物的電荷異異構體的分析非常關鍵。蛋白質藥物和抗體藥物的電荷異質性表征在生產和純化過程中，蛋白質能表現(xiàn)出多種電荷異質性改變，22藥物差異化表征3種不同的IgG：人源與鼠源差異明顯藥物差異化表征3種不同的IgG：人源與鼠源差異明顯23HSA:廠家1HSA:廠家2HSA:廠家3國內3廠家的人血清白蛋白HSAHSA:廠家1HSA:廠家2HSA:廠家3國內24細胞株篩選標準對照細胞株1細胞株2細胞株3細胞株4細胞株5細胞株篩選標準對照細胞株1細胞株2細胞株3細胞株4細25蛋白質藥物的穩(wěn)定性研究在25℃、40℃、65℃

三個Incubation溫度條件下，目標蛋白質構象保持穩(wěn)定，四個電荷異構體的CIEF-WCID電泳圖沒有明顯差異；在25℃、40℃、65℃

三個Incubation溫度條件下，四個電荷異構體的pI值完全一致，說明在65oC的高溫下，蛋白質沒有變性，其構象穩(wěn)定。

每個溫度下的樣品重復二次分析，其重復性出色，pI值測定的RSD<1%。25oC40oC65oC1234蛋白質藥物的穩(wěn)定性研究在25℃、40℃、65℃三個Inc26將Incubation溫度持續(xù)提高到75℃，研究發(fā)現(xiàn)其CIEF-WCID的電泳圖發(fā)生顯著改變（與25-65℃），意味著蛋白質發(fā)生明顯變性，其構象完全改變，75℃為其構象改變的臨界溫度；

在75℃的溫度下，與25-65℃相比，四個主要電荷異構體的峰消失，形成一個“寬包”峰（pI范圍7.4-8.3），整體pI點向酸性位移；在75℃的溫度下，整體pI點向酸性位移，意味著蛋白質變性，更多的酸性功能基團暴露。65oC75oC將Incubation溫度持續(xù)提高到75℃，研究發(fā)現(xiàn)27定量分析mAb定量分析mAb28ADCADC29FusionProteinFusionProtein30報告內容報告內容31PreparativecIEFcIEF-WCIDtandemMSAES獨有專利技術在完成cIEF-WCID聚焦分離后，在移動聚焦蛋白區(qū)帶的過程中，分辨率不會發(fā)生明顯的降低AES在生物制藥和蛋白質組學研究中的重要突破PreparativecIEFAES獨有專利技術AES在32SchematicofCEInfinitescanningimagingpreparativeCIEFPreparativeCIEFwithCEInfiniteproprietarycartridges(patentpending)allowsthefocusedpeakstobetransferredintoindividualcollectionvialsorionsourcesofmassspectrometers(MS)forfurtherstructurebasedcharacterization.ProteinPeakTransferSchematicofCEInfinitescanni33PreparativescanningimagingCIEFhemoglobinAFSCindividualpeakcollection1.PreparativecIEF----StepA:FractionationPreparativescanningimagingC34CIEFconfirmationofindividualpeakcollectionPreparativecIEF----StepB:cIEFconfirmationCIEFconfirmationofindividua352.cIEF-WCIDtandemMS:newbreakthroughforproteinidentification2.cIEF-WCIDtandemMS:newbr36報告內容報告內容37

生物大分子、蛋白質-藥物之間的相互作用能夠直接反應其功能和活性機制。相互作用的研究在蛋白質藥物和疫苗藥物的研發(fā)和生產中起到非常重要作用，不僅能夠闡明治病機理、藥理機理，而且對于蛋白質藥物的質量控制和生產工藝起到決定性的作用。CEInfinite:抗體藥物表征的利器WuXZ,HuangTM.etal.,JournalofMicrocolumnSeparation.,13,322-326,2001生物大分子、蛋白質-藥物之間的相互作用能夠直接反應其功38ProteinControlProtein-Compound1Protein-Compound2pI7.30pI7.26pI7.30pI7.32

蛋白質-小分子藥物1：Protein從單一峰分叉變成兩個峰，很清楚的表明相互作用的產生。此復合物的pI向堿性區(qū)域移動0.02pI單位，標志著由于相互作用，蛋白質構象發(fā)生改變，其表面負電荷被遮蔽，正電荷密度增強（推測次此小分子可能為堿性藥物）。而且，所加入的小分子藥物的摩爾比偏低，蛋白質沒有發(fā)生完全作用（原型蛋白被部分保留)，繼續(xù)加大小分子藥物濃度，可能會觀察到多作用靶點的存在（多個復合物的峰)；初步推測此相互作用是動態(tài)可逆過程；蛋白質-小分子藥物2：與Control相比，仍然保持單一峰，但其pI為7.26，向酸性區(qū)域移動0.04pI單位，標志著由于相互作用，蛋白質構象發(fā)生改變，其表面正電荷被遮蔽，負電荷密度增強（推測次此小分子可能為酸性藥物）。而且由于原型蛋白基本消失，表明蛋白質和小分子藥物完全發(fā)生反應形成復合物，而且形成復合物的速度（K值）大于其解離速度，由于復合物的峰較寬，而且存在肩峰，推測存在多靶點的相互作用，從而產生多重蛋白質-小分子藥物的復合物。ProteinControlProtein-Compoun39Proteinmoleculecomplex*Protein*pI9.33**********CalculationofKdandkon,koffcanbedonewithanovelmethod.MakeproteinandsmallmoleculesolutioninIEFsolutionwithproteinat0.0001M,andsmallmoleculeat0.0001M.TheincreaseofproteinpeakanddecreaseofproteincomplexwereobservedintheE-gram.0S67S134S201S302SKoffCalculationmethodforKDTheinitialproteinconcentrationwas0.0001M,andsmallmoleculeat0.0001M.Theequilibriumproteinconcentrationcanbecalculated0.00009M.Theequilibriumsmallmoleculeconcentrationwascalculated0.00009M.TheKdcanbecalculatedtobe8.110-4M,andKb1.2103M-1The

applicationwascooperatedwithRockDan’sGroupfromAmgen,Seattle.Proteinmoleculecomplex*Prot40CEInfinite:研發(fā)新進展TemperaturecontroloftheseparationchamberinCEInfiniteC01CGECartridgedevelopmen