壁虎多糖對h22肝癌細(xì)胞體外抑瘤作用的研究

保護宮是壁虎科動物無瘤無瘤（gelkoswenner）或其他壁虎去除內(nèi)臟的全部。它是一種傳統(tǒng)的冷、熱、硬、中藥，具有驅(qū)風(fēng)、定痛、溶解粘液和解毒的功效。大量研究報道壁虎有顯著的抗腫瘤作用(尤其對消化系統(tǒng)腫瘤)。本課題組前期實驗也證實干、鮮壁虎對小鼠H22肝癌具有確切的抑制作用。但壁虎成分十分復(fù)雜,究竟是何種成分發(fā)揮抗腫瘤作用,目前還不清楚,吳雄志等從守宮中分離得到硫酸守宮多糖,發(fā)現(xiàn)該成分可以抑制肝癌細(xì)胞BEL-7402的增殖并誘導(dǎo)分化,而對正常肝細(xì)胞L-02的生長發(fā)育幾乎沒有影響。對此筆者就壁虎多糖的抗腫瘤作用進行了進一步探討。1材料和方法1.1壁虎多糖的制備壁虎多糖的制備參照吳雄志專利提供的方法。加工過程:干無蹼壁虎1000g粉碎為粗粉,置于4000mL甲醇中,60℃水浴浸提3h,2h各1次,過濾,藥渣以8000mL蒸餾水90~100℃水浴提取3h,2h各1次,6000mL蒸餾水90~100℃水浴提取1h1次,過濾,合并3次水提藥液,2000r/min,20min離心除去沉淀,濃縮至1500~2000mL,緩緩加入乙醇至30%濃度,邊加邊攪拌,靜置去沉淀,藥液再緩緩加乙醇至80%濃度,邊加邊攪拌,收獲沉淀,沉淀用蒸餾水400mL溶解,濾除不溶物,緩緩加乙醇至80%濃度,邊加邊攪拌,收取沉淀,用無水乙醇洗滌3次,真空干燥,碾細(xì)即得,共得壁虎多糖20.3g。去離子水配置多糖溶液,體內(nèi)濃度:200g/L即為高劑量組,100g/L為低劑量組。-20℃冰箱備用。氟尿嘧啶注射液(上海旭東海普藥業(yè)有限公司),批號050510,加入適量的生理鹽水中配至3kg/L。體外實驗用的壁虎多糖濃度為100g/L,體外實驗所用多糖及氟尿嘧啶注射液需用0.22μm微孔無菌濾器過濾除菌。RPMI-1640培養(yǎng)液和胎牛血清(Gibco),四甲基偶氮唑鹽(MTT),二甲基亞砜(DMSO,Solarbio)。昆明小鼠,體質(zhì)量(24±1)g,40只,雌雄各半。購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,許可證號:SCXK(京)2002-2003。小鼠H22肝癌種鼠購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)藥物研究所。1.2方法1.2.1壁虎糖對p2肝癌細(xì)胞的外源性抑制腫瘤細(xì)胞生長抑制率%=(1-實驗組A570nm均值/對照A570nm均值)×100%1.2.2壁虎多糖高、低劑量對小鼠體內(nèi)細(xì)胞指標(biāo)的影響H22荷瘤小鼠腹腔腫瘤細(xì)胞分別接種于小鼠腹腔連續(xù)傳代,無菌抽取7d齡小鼠腹腔腫瘤細(xì)胞,加入生理鹽水調(diào)整細(xì)胞懸液中腫瘤細(xì)胞濃度至4×109個/L。于每只小鼠右腋下注射0.2mL腫瘤細(xì)胞懸液。24h后,隨機將小鼠分為4組:模型組,西藥組,壁虎多糖高、低劑量組。每組10只小鼠,各組間體質(zhì)量無差異(P>0.05)。模型組以生理鹽水0.2mL/d灌胃。西藥組以5-Fu(濃度為3g/L)0.2mL隔天腹腔注射。多糖組分別以200g/L,100g/L灌胃給藥,每只小鼠灌胃量為0.2mL/d。連續(xù)給藥12d后,第13天引頸處死小鼠,剝瘤、稱質(zhì)量、計算抑瘤率。局部實體瘤生長的抑制率=(1-實驗組平均瘤重/模型組平均瘤重)×100%。對免疫器官的影響引頸處死小鼠后,立即分離胸腺和脾臟,剔除周圍結(jié)締組織和脂肪,用濾紙吸干臟器表面水分,稱質(zhì)量,計算臟器指數(shù)。胸腺(脾臟)指數(shù)=胸腺(脾臟)質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件,數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。組間比較采用單因素方差分析,檢驗水準(zhǔn)α=0.05。2結(jié)果2.1體外增殖抑制率壁虎多糖各劑量均可抑制H22細(xì)胞的體外增殖,其抑制率最高為79.1%,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于西藥抑瘤率48.7%。此實驗重復(fù)3次,重復(fù)性較好。見表1。2.2內(nèi)部腫瘤實驗2.2.1影響b22蓮花腫瘤大鼠的體重實驗結(jié)果顯示,西藥組小鼠體質(zhì)量較對照組明顯減輕(P<0.05)。多糖組小鼠的體質(zhì)量較對照組無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表2。2.2.2影響p22蓮花腫瘤生長壁虎多糖高劑量組的抑瘤率僅為8.8%,與模型組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表2。2.2.3量、脾指數(shù)檢測壁虎多糖組與對照組小鼠的胸腺質(zhì)量、胸腺指數(shù),脾臟質(zhì)量、脾臟指數(shù)均沒有明顯差異(P>0.05)。而西藥組胸腺質(zhì)量、胸腺指數(shù),脾臟質(zhì)量、脾臟指數(shù)較對照組和各壁虎不同部分組明顯降低(P<0.05)。見表3。3壁虎多糖的活性生物活性多糖是指一類對人體具有某種特殊生物學(xué)功能的高分子碳水化合物聚合體。它們廣泛存在于自然界中的動物、植物、微生物和海洋生物等所有生物體內(nèi),資源豐富。具有抗病毒、抗腫瘤與免疫調(diào)節(jié)作用。動物多糖存在和分布極為廣泛,幾乎存在于所有動物組織器官中。分布不是均一的,而是隨組織類型而定。多糖目前主要被用于提高機體免疫力,抗腫瘤,降血脂等方面。生物活性多糖的抗腫瘤作用是通過調(diào)節(jié)和提高機體免疫力、抗氧化、抗自由基損傷、抗突變、抗輻射、誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化與凋亡、直接殺傷癌細(xì)胞等多種機制協(xié)同作用而實現(xiàn)的。吳雄志等從守宮中分離得到硫酸守宮多糖,發(fā)現(xiàn)該成分可以抑制肝癌細(xì)胞BEL-7402的增殖并誘導(dǎo)分化,而對正常肝細(xì)胞L-02的生長發(fā)育幾乎沒有影響,閆祝辰等研究發(fā)現(xiàn)守宮多糖可促進淋巴細(xì)胞的增殖,增強肝癌抗原活化的淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒作用,同時對淋巴細(xì)胞的增殖有直接的促進作用。對此我們就壁虎多糖部分的抗腫瘤作用進行了進一步探討。體外實驗顯示:壁虎多糖不同劑量組均可抑制H22細(xì)胞的增殖,其抑制率最高為79.1%,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于西藥48.7%的抑瘤率,與吳雄志結(jié)論一致。然而體內(nèi)實驗中,壁虎多糖高劑量組的抑瘤率僅為8.8%,與模型組比較無統(tǒng)計學(xué)差異。體外實驗出現(xiàn)高的抑瘤率,是否與多糖提取物中,可能含有無機鹽、蛋白質(zhì)、色素及醇不溶的小分子有機物(如低聚糖)等雜質(zhì),從而影響體外實驗結(jié)果。因此有必要對提取所得多糖純度進行檢測。體內(nèi)實驗所確定的劑量已經(jīng)接近多糖水溶液飽和度,結(jié)果仍然不能顯示良好的抑瘤率。吳雄志等的實驗結(jié)果也僅限于體外實驗,未結(jié)合體內(nèi)抑瘤實驗,不能作為有效成分篩選的確切證據(jù),多糖到底是不是壁虎發(fā)揮抗肝癌作用的有效成分,值得進一步商榷。H22荷瘤小鼠腹腔腫瘤細(xì)胞分別接種于小鼠腹腔連續(xù)傳代,無菌抽取7d齡小鼠腹腔腫瘤細(xì)胞,用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整腫瘤細(xì)胞濃度至1×105個/L。接種于96孔板,每孔100μL。實驗設(shè)對照組,壁虎多糖高、中、低劑量組,西藥5-Fu組,共5組,每組設(shè)8個復(fù)孔。壁虎多糖低、中、高劑量組分別加入濃度為100g/L的壁虎多糖液5、10、15μL。西藥5-Fu組,每孔加入濃度為3g/L的5-FU液25μL,調(diào)整板內(nèi)各孔液體總量,使其均為200μL。不足者補以含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液。培養(yǎng)板置于37℃,5%二氧化碳(