...wd......wd......wd...一，簡(jiǎn)單的3步驟程序。1.將收集到的細(xì)胞和待轉(zhuǎn)染的分子〔例如DNA，RNA，siRNA〕的混合物參加到提取物中。2.將帶專(zhuān)用槍頭的移液器插入帶有電極杯的移液器座中;在設(shè)備上選擇程序，然后按開(kāi)場(chǎng)。3.拔下移液器，將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有適當(dāng)培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器中。注：1.為了防止污染，強(qiáng)烈建議只使用電極杯10次。建議在切換到不同質(zhì)粒DNA/siRNA或細(xì)胞類(lèi)型時(shí)更換電極杯和緩沖液2.為了確保重復(fù)性和排除轉(zhuǎn)染條件的變化，建議不要使用槍頭超過(guò)2次二，軟件操作程序1.按下電源開(kāi)關(guān)〔位于設(shè)備反面，第vii頁(yè)〕翻開(kāi)Neon?設(shè)備。本機(jī)檢查確保Neon?移液器站已連接到設(shè)備，然后顯示啟動(dòng)屏幕。2.按Voltage啟動(dòng)數(shù)字鍵盤(pán)輸入電壓值。按所需的電壓值，然后按Done保存該值。注意：如果任何輸入值超出限制，則會(huì)顯示錯(cuò)誤信息，并自動(dòng)設(shè)置最小的限制值。3.按Width激活數(shù)字鍵盤(pán)輸入寬度值。按所需的寬度值，然后按Done保存該值。4.按Pulses激活數(shù)字鍵盤(pán)以輸入脈沖值。按所需的脈沖值，然后按Done保存該值。5.如果要保存這些電穿孔參數(shù)，請(qǐng)按主屏幕上的“Save〞將程序保存在數(shù)據(jù)庫(kù)中。6.按所需的程序號(hào)碼編輯程序。選定的程序會(huì)突出顯示。7.顯示“Edit〞屏幕后，按鍵盤(pán)按鈕輸入用戶(hù)名。光標(biāo)自動(dòng)移動(dòng)到下一個(gè)字段協(xié)議，并突出顯示為紅色。繼續(xù)輸入Voltage，Width和Pulses信息。8。按Enter鍵將信息保存在數(shù)據(jù)庫(kù)中。9.繼續(xù)準(zhǔn)備細(xì)胞和DNA，并設(shè)置用于電穿孔的移液器座三，細(xì)胞與DNA混合物準(zhǔn)備本卷須知：1.將純化的DNA重懸于1-5μg/μL濃度的去離子水或TE緩沖液〔10mMTrisHCl，1mMEDTA，pH8.0〕中。濃度可能因細(xì)胞類(lèi)型而異。2.DNA量不應(yīng)超過(guò)使用總體積的10％。3.通過(guò)測(cè)量A260/280比例來(lái)檢查純化的DNA制劑的純度。電穿孔的比例應(yīng)至少為1.8。4.該裝置已經(jīng)用4-7kb質(zhì)粒進(jìn)展常規(guī)測(cè)試，質(zhì)粒高達(dá)約20kb不應(yīng)該是問(wèn)題。使用大于20kb的質(zhì)粒很可能降低轉(zhuǎn)染效率。5.不要用乙醇沉淀DNA以濃縮DNA。通過(guò)乙醇沉淀的濃縮DNA顯示差的轉(zhuǎn)染效率和由于鹽污染導(dǎo)致的細(xì)胞活力。6.不含Ca2+和Mg2+的D-PBS或磷酸鹽緩沖鹽水〔PBS〕〔第40頁(yè)〕流程：1.用3mL電解緩沖液〔使用緩沖液E，10μLNeon?Tip和BufferE2，100μLNeon?Tip〕填充電轉(zhuǎn)杯。〔確保管子側(cè)的電極完全浸入緩沖液中?！?.將電極杯插入移液器座，直到聽(tīng)到咔嗒聲。確保Neon?管的側(cè)面電極與Neon?移液器站的側(cè)球柱塞良好連接〔見(jiàn)以以下圖左側(cè)正確位置〕3.在電穿孔前一天，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到具有新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，使得細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天為70-90％集合。4.對(duì)于大多數(shù)優(yōu)化協(xié)議，每10μLNeon?Tip可提供5×104-2×105個(gè)細(xì)胞?！?×105-2×106個(gè)細(xì)胞每100μLNeon?Tip適用于大多數(shù)優(yōu)化的方案?！?.將含有血清，PBS〔不含Ca2+和Mg2+〕和胰蛋白酶/EDTA溶液的培養(yǎng)基的等分試樣預(yù)溫至37℃。從培養(yǎng)瓶中吸出培養(yǎng)基，并使用PBS〔不含Ca2+和Mg2+〕沖洗細(xì)胞。使用胰蛋白酶/EDTA或TrypLEExpress〔目錄號(hào)12563〕對(duì)細(xì)胞進(jìn)展胰蛋白酶消化。取一等份的胰蛋白酶化細(xì)胞懸浮液并計(jì)數(shù)細(xì)胞以確定細(xì)胞密度。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到1.5mL微量離心管或15mL錐形管中，并在室溫下以100-400×g離心細(xì)胞5分鐘。通過(guò)在室溫下以100-400×g離心5分鐘，用PBS〔不含Ca2+和Mg2+〕清洗細(xì)胞。吸出PBS并以1.0×107個(gè)細(xì)胞/mL的最終密度將細(xì)胞沉淀重懸于ResuspensionBufferR中。輕輕移液細(xì)胞以獲得單細(xì)胞懸浮液。防止在室溫下儲(chǔ)存細(xì)胞懸浮液超過(guò)15-30分鐘，從而降低細(xì)胞存活力和轉(zhuǎn)染效率?？梢哉{(diào)整重懸細(xì)胞密度以適應(yīng)電穿孔方案〔第18頁(yè)〕或優(yōu)化方案〔第24-29頁(yè)〕的推薦細(xì)胞數(shù)。6.通過(guò)用含有血清和補(bǔ)充劑的0.5mL培養(yǎng)基將孔插入24孔板，不用抗生素，并在潮濕的37℃/5％CO2培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)板。如果您使用其他培養(yǎng)板，請(qǐng)參見(jiàn)第18頁(yè)電鍍介質(zhì)卷建議。7.對(duì)于每個(gè)電穿孔樣品，下面列出了每孔的質(zhì)粒DNA或siRNA的推薦量，細(xì)胞數(shù)量和電鍍培養(yǎng)基的體積。使用再懸浮緩沖液T作為初級(jí)懸浮液8.使用3mL電解緩沖液〔使用緩沖液E，10μLNeon?Tip和緩沖液E2，100μLNeon?Tip〕裝入Neon?移液管9.根據(jù)您的單元格類(lèi)型在設(shè)備上設(shè)置所需的脈沖條件10.將適量的質(zhì)粒DNA/siRNA轉(zhuǎn)移到無(wú)菌的1.5mL微量離心管中。11.將細(xì)胞參加到含有質(zhì)粒DNA/siRNA的管中，輕輕混合。請(qǐng)參見(jiàn)上表，了解細(xì)胞濃度，DNA和電鍍量。12.要將Neon?Tip插入Neon?移液器，請(qǐng)將移液器上的按鈕按到第二個(gè)停頓位置以翻開(kāi)夾具13.將Neon?移液器的頂部插入Neon?Tip，直到夾具完全拿起活塞的安裝桿〔見(jiàn)以以下圖〕14.輕輕釋放按鈕，繼續(xù)向移液器施加向下的壓力，確保尖端密封在移液管上，沒(méi)有間隙。注意：確保Neon?移液器和尖端嚴(yán)密連接，無(wú)間隙〔見(jiàn)左圖〕，無(wú)故障移液和正確的電氣連接15.將Neon?移液器上的按鈕按到第一站，并將Neon?Tip浸入細(xì)胞DNA/siRNA混合物中。緩慢釋放移液器上的按鈕，將細(xì)胞DNA/siRNA混合物吸入Neon?Tip。在移液過(guò)程中防止氣泡，因?yàn)闅馀菰陔姶┛灼陂g導(dǎo)致電弧，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染降低或失敗。如果您注意到尖端中有氣泡，請(qǐng)丟棄樣品，并小心地將新鮮樣品再次吸入尖端，無(wú)任何氣泡。16.將帶有樣品的Neon?移液器垂直插入放置在Neon?移液器站中的Neon?Tube，直至聽(tīng)到咔嗒聲。確保移液器突起插入吸液管的槽中。17.確保Neon?移液器的金屬頭與Neon?移液器支架內(nèi)的球形活塞和Neon?Tube〔見(jiàn)左圖所示的正確位置〕嚴(yán)密連接。18.在傳送電脈沖之前，Neon?設(shè)備會(huì)自動(dòng)檢查Neon?Tube和Neon?Pipette是否正確插入。19.在電穿孔期間監(jiān)測(cè)Neon?Tip，以查看是否有由于尖端存在氣泡引起的電弧〔火花〕。電弧導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低，細(xì)胞活力低。20.交付電脈沖后，觸摸屏上將顯示“Complete〞以指示電穿孔完成。21.從Neon?移液器站慢慢移除Neon?移液器，并立即從Neon?Tip中將樣品從移液器上按下第一個(gè)停留點(diǎn)，放入含有預(yù)熱培養(yǎng)基的準(zhǔn)備培養(yǎng)基中。22.我們強(qiáng)烈建議將電穿孔細(xì)胞加載到?jīng)]有抗生素的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，這可以大大降低轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的活力。23.要放棄Neon?Tip，請(qǐng)按第二個(gè)按鈕的按鈕進(jìn)入適當(dāng)?shù)纳镂ｋU(xiǎn)廢物容器。24.對(duì)剩余的樣品重復(fù)步驟7-16。使用兩次后，請(qǐng)務(wù)必更換Neon?Tips，并在10次使用后更換Neon?Tubes。每個(gè)新的質(zhì)粒DNA樣品使用新的Neon?Tip和Neon?Tube25.輕輕搖動(dòng)板，以確保細(xì)胞的均勻分布。在37℃下在加濕的CO2培養(yǎng)箱中孵育該板。注意1.如果您沒(méi)有使用Neon?設(shè)備，將后面的電源開(kāi)關(guān)轉(zhuǎn)到OFF位置。2.防止在Neon?移液器臺(tái)內(nèi)溢出任何液體，以防止移液器臺(tái)上的球塞上產(chǎn)生銹跡。3.如果您不小心將任何液體〔如緩沖液，水，咖啡〕濺入Neon?移液器站內(nèi)，請(qǐng)將主機(jī)從主設(shè)備上斷開(kāi)，并用枯燥的實(shí)驗(yàn)室紙擦拭。倒置并允許車(chē)站在室溫下完全枯燥24小時(shí)。優(yōu)化流程1.確保您按照第16-17頁(yè)所述制備細(xì)胞，使用DNA或siRNA，并制備含有0.5mL含有血清和無(wú)抗生素的培養(yǎng)基的24孔板，以轉(zhuǎn)移電穿孔細(xì)胞。準(zhǔn)備足夠的細(xì)胞和質(zhì)粒DNA/siRNA進(jìn)展至少30次轉(zhuǎn)染。2.對(duì)于使用24孔格式的10μLNeon?Tip的每個(gè)電穿孔樣品，請(qǐng)參見(jiàn)下表。對(duì)于以24孔格式使用100μLNeon?Tip，請(qǐng)將下表中列出的數(shù)值適當(dāng)調(diào)整10倍。3.使用3mL電解緩沖液〔將緩沖液E用于10μLNeon?Tip和緩沖液E2，100μLNeon?Tip〕置于含有細(xì)胞DNA/siRNA混合物的Neon?移液站中，如第15頁(yè)所述。4.按優(yōu)化和加載優(yōu)化協(xié)議