單次腹腔注射lps后大鼠腦內(nèi)神經(jīng)元和小膠質(zhì)細胞的表達

神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)之間存在雙向信息交流，主要任務(wù)的反應(yīng)受到神經(jīng)系統(tǒng)（cns）的調(diào)節(jié)。已知腦內(nèi)存在廣泛的神經(jīng)元-膠質(zhì)細胞信息網(wǎng)絡(luò)。在CNS病損時,神經(jīng)元發(fā)生形態(tài)、功能的改變,同時膠質(zhì)細胞也發(fā)生變化,小膠質(zhì)細胞作為腦組織中固有的免疫效應(yīng)細胞,可從靜止變?yōu)榧せ顮顟B(tài),以助于宿主防御和修復(fù)。機體受到外周免疫刺激,小膠質(zhì)細胞的改變及與神經(jīng)元的關(guān)系尚未見報道。脂多糖(LPS)是革蘭陰性桿菌的細胞壁的主要成分,在免疫應(yīng)答研究中常被作為一種多克隆免疫激發(fā)劑來模擬機體免疫激發(fā)狀態(tài),是研究免疫系統(tǒng)與神經(jīng)系統(tǒng)之間信息交流的常用模型。本實驗單次腹腔注射LPS,利用免疫組織化學方法觀察反應(yīng)性神經(jīng)元(以Fos作標記物)和小膠質(zhì)細胞(以O(shè)X42作標記物)在前腦的分布、時間規(guī)律及相互關(guān)系。1材料和方法1.1飼養(yǎng)環(huán)境及飼養(yǎng)時間成年SD大鼠49只,體重240～300g,安靜溫暖、避強光的環(huán)境中飼養(yǎng)48h。隨機分為實驗組(n=42)和對照組(n=7)。1.2血液流變學1%戊巴比妥鈉大鼠清醒狀態(tài)下,迅速腹腔注射100μg/kg的LPS(Sigma),對照組用生理鹽水300μl替代LPS做腹腔注射,分別存活30min,1,3,6,12,24和72h(每組n=6)后用1%戊巴比妥鈉(80mg/kg)麻醉,經(jīng)左心室至升主動脈插管,100ml生理鹽水沖洗血液,含4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(PB,pH7.4,4℃)灌注固定。腦組織置于含20%蔗糖的0.1mol/LPB內(nèi)(4℃)至沉底。冷凍冠狀切片,片厚30μm。切片收集于0.01mol/LPBS中。1.3抗th-abc法切片入80%甲醇/雙氧水20min,PBS液充分漂洗,入0.3%TritonX-100處理后,切片分為3套,按ABC法分別進行抗FOS和OX42單標和抗FOS/OX42/TH(酪氨酸羥化酶)三標免疫組織化學反應(yīng)。以三標為例,簡述反應(yīng)過程。依次孵育于:(1)兔抗Fos(1∶3000,SantaCruz)和鼠抗OX42(1∶3000,Chemicon)的混合抗體稀釋液24h(4℃);(2)生物素標記的羊抗兔IgG(1∶500,Sigma)和驢抗鼠IgG(1∶500,Sigma)的混合稀釋液2h(室溫);(3)生物素-卵白素-HRP復(fù)合物(ABC,1∶500,Sigma)2h(室溫)。以上每一步驟之后均用PBS液充分漂洗3次,每次10min,最后用葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸鎳胺法顯色,陽性產(chǎn)物呈藍色。顯色后,再依次進行抗TH的ABC法染色:(1)鼠抗TH單克隆抗體(1∶3000,Incstar),孵育24h(4℃);(2)生物素標記的驢抗鼠IgG(1∶500,Sigma),3h(室溫);(3)ABC復(fù)合物(ABC,1∶500,Sigma),2h(室溫);(4)葡萄糖氧化酶-DAB溶液呈棕色20min,室溫然后常規(guī)裱片、脫水、透明、DPX封固、光鏡觀察。1.4替代實驗取實驗組切片,用0.01mol/LPBS分別替代抗Fos或抗OX42抗體稀釋液,按ABC法進行免疫組化染色,結(jié)果為陰性。1.5圖像大鼠fos陽性神經(jīng)元的計數(shù)光鏡下(BX-60,Olympus,Japan)觀察并應(yīng)用Leica公司的Quantimet570c圖像分析儀采集圖像。對FOS陽性神經(jīng)元進行計數(shù),每組共計6只大鼠,每只大鼠2張下丘腦室旁核最大平面切片,60×視野所得。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,進行兩因素兩水平方差分析(two-wayANOVA)。2結(jié)果2.1fos陽性矩陣2.1.1前后腦結(jié)構(gòu)的分區(qū)對照組大鼠腦內(nèi)FOS陽性神經(jīng)元的數(shù)量少,染色淺,散在分布。實驗組大鼠腦內(nèi)Fos陽性神經(jīng)元的數(shù)量明顯增加并有區(qū)域分布特點。前腦的額頂皮質(zhì)、扣帶皮質(zhì)(Fig1A)Fos陽性神經(jīng)元密集分布;梨狀皮質(zhì)、外側(cè)隔核腹側(cè)部、中央杏仁核次之;海馬的CA2區(qū)、CA3區(qū)、齒狀回有中等密度分布。間腦主要分布于丘腦室旁核、下丘腦視上核(Fig1B)、室旁核(Fig1C)、弓狀核、下丘腦外側(cè)區(qū)和第三腦室周圍灰質(zhì)等。2.1.2fos陽性胞核檢測根據(jù)LPS刺激后PVN內(nèi)各時點Fos陽性胞核數(shù)目統(tǒng)計發(fā)現(xiàn),刺激后30minFos陽性胞核出現(xiàn),1h數(shù)量明顯增加,染色加深,3h有所下降,6h后明顯減低,72h有回升趨勢,略高于12h組(Fig2)。2.2ox42陽性小膠質(zhì)細胞的檢測對照組僅在第三腦室周圍灰質(zhì)有微弱表達,染色淡,胞體小,分支細、短。實驗組(Fig1D～G)LPS注射后1h可見到OX42陽性小膠質(zhì)細胞,3h數(shù)量增多,6h達到高峰。反應(yīng)性O(shè)X42陽性小膠質(zhì)細胞的染色變深,胞體變大,分支增粗,支上的棘狀物增粗增多。在扣帶回、海馬、下丘腦室旁核、第三腦室室周灰質(zhì)等Fos陽性神經(jīng)元分布較多的腦區(qū),OX42陽性小膠質(zhì)細胞也深染和密集分布。2.3li神經(jīng)元的胞核和th-li水理學三重染色切片鏡下可見Fos-LI或TH-LI神經(jīng)元、Fos/TH-LI雙標神經(jīng)元,以及OX42-LI小膠質(zhì)細胞。在Fos-LI神經(jīng)元與OX42-LI小膠質(zhì)細胞之間,TH-LI神經(jīng)元與OX42-LI小膠質(zhì)細胞之間,Fos/TH-LI雙標神經(jīng)元與OX42-LI小膠質(zhì)細胞之間顯示出密切的關(guān)系。Fos-LI神經(jīng)元的胞核呈黑藍色,胞質(zhì)不著色;TH-LI神經(jīng)元胞質(zhì)呈棕色,胞核不著色。OX42-LI小膠質(zhì)細胞呈黑藍色“雪花狀”分支。Fos/TH-LI雙標神經(jīng)元,在棕色胞質(zhì)內(nèi)有圓形或卵圓形黑藍色胞核。TH-LI神經(jīng)元的棕色胞體和突起,被藍黑色的OX42-LI小膠質(zhì)細胞的突起包繞或接觸;Fos-LI的藍黑色神經(jīng)元胞核周圍,有藍黑色OX42-LI小膠質(zhì)細胞突起,兩者之間可有微小未著色空隙;Fos/TH-LI雙標神經(jīng)元為藍黑色胞核在均勻棕黃色胞質(zhì)內(nèi),周圍被藍黑色的OX42-LI小膠質(zhì)細胞的突起包繞或接觸。這些細胞主要分布于下丘腦室旁核,第三腦室周圍灰質(zhì)等。因Fos和OX42高峰不同,選取包含下丘腦室旁核的連續(xù)5張切片,計數(shù)6h時間點的第三腦室周圍灰質(zhì)Fos/TH-LI雙標神經(jīng)元與OX42-LI小膠質(zhì)細胞接觸關(guān)系,以Fos/TH-LI神經(jīng)元胞體與“雪花狀”分支的OX42-LI小膠質(zhì)細胞的密切接觸為標準,占Fos/TH-LI雙標神經(jīng)元的85%,占TH-LI神經(jīng)元與OX42-LI小膠質(zhì)細胞接觸形式的34%。3小膠質(zhì)細胞激活免疫系統(tǒng)與神經(jīng)系統(tǒng)之間存在雙向信息交流,宿主對炎性的反應(yīng)和局部組織修復(fù)受到CNS的調(diào)節(jié),存在免疫系統(tǒng)與大腦的通訊。(1)血源性通路,細胞因子參與其中。細胞因子多途徑入腦,并且CNS產(chǎn)生新的細胞因子;(2)神經(jīng)通路,外周免疫刺激引起傳入神經(jīng)(如迷走神經(jīng))活動,信息快速傳入大腦。尤其當血循環(huán)中細胞因子水平低時(如炎癥早期)和局部炎性刺激迷走神經(jīng),神經(jīng)系統(tǒng)對機體的調(diào)節(jié)迅速發(fā)生。Fos蛋白作為神經(jīng)元活動狀態(tài)的標記物,已被廣泛采用。本實驗發(fā)現(xiàn)LPS注射后30min,在腦內(nèi)的一定區(qū)域有Fos陽性神經(jīng)元分布,1～3h為表達高峰,表明大鼠腦對外周免疫刺激的調(diào)節(jié)反應(yīng)是快速的。Yang等和Ge等發(fā)現(xiàn)切斷迷走神經(jīng)后,再給予腹腔注射LPS,大腦Fos蛋白表達明顯減少。Brady的c-fosmapping的研究也證實神經(jīng)通路的存在。小膠質(zhì)細胞作為腦組織中固有的免疫效應(yīng)細胞有三種狀態(tài):(1)正常狀況時的靜止狀態(tài);(2)非噬菌性反應(yīng)性狀態(tài),多為CNS產(chǎn)生炎性反應(yīng)時出現(xiàn);(3)噬菌性反應(yīng)性狀態(tài),常出現(xiàn)在CNS創(chuàng)傷和感染時。CNS受到免疫刺激時,小膠質(zhì)細胞從靜止變?yōu)榧せ顮顟B(tài),被激活的早期表現(xiàn)胞體增大,突起變粗,染色深。小膠質(zhì)細胞激活后,其功能一方面釋放炎性因子和趨化調(diào)節(jié)因子,擴大神經(jīng)損傷;另一方面釋放神經(jīng)保護成分,認為小膠質(zhì)細胞在CNS維持信息整合中扮演角色。有實驗表明腦對LPS的免疫反應(yīng)是劑量相關(guān)的。低濃度LPS刺激培養(yǎng)小膠質(zhì)細胞,OX42-LI小膠質(zhì)細胞增多,高濃度刺激數(shù)量減少,染色濃重。Neuron-glia混合培養(yǎng),低劑量LPS(0.01～10μg/kg)未引起小膠質(zhì)細胞形態(tài)改變,高劑量LPS(>500μg/kg),OX42-LI小膠質(zhì)細胞分支增粗,數(shù)量隨LPS劑量增加而增加。Laia對大鼠活體興奮性毒性損傷的研究,發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細胞能夠表達IL-1b和TNFa。Hansen發(fā)現(xiàn)腹腔注射LPS(10～100μg/kg)后,大鼠下丘腦、海馬等處IL-1β蛋白水平增加,呈劑量依賴性。而LPS劑量的高低與細胞因子分布部位有關(guān),腹腔注射大量LPS(>500μg/kg),IL-1b和TNFamRNA全腦表達;小量注射時(0.01～10μg/kg),其表達僅在近脈絡(luò)膜、室周器官(CVOs)、軟腦膜下腦實質(zhì)處。本實驗為單次腹腔注射LPS(100μg/kg),小膠質(zhì)細胞表現(xiàn)為早期激活狀態(tài)。先于腦室周圍灰質(zhì)出現(xiàn),6h達到高峰,對應(yīng)于Fos-LI神經(jīng)元表達多的核團(如PVN)深染和密集;形態(tài)改變?yōu)榘w變大,分支增粗,支上的嵴狀物增粗、增多。在表達部位上小膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元有一致性。外周免疫刺激,小膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元均活化,細胞因子可能參與其中。在免疫刺激信息入腦過程中,體液通路的作用緩慢而持久。通過大腦脈管系統(tǒng)和CVOs入腦的IL-1β啟動一種遲緩的空間效應(yīng)。IL-1β介導(dǎo)產(chǎn)生某種細胞因子。當IL-1β與其受體結(jié)合,激活信號傳導(dǎo)通路,誘導(dǎo)IL-1β和其他因子的基因轉(zhuǎn)錄。新產(chǎn)生的IL-1β以paracrine形式,又介導(dǎo)較遠區(qū)域的細胞產(chǎn)生IL-1β。有學者認為,外周的細胞因子介導(dǎo)腦內(nèi)新的細胞因子由膠質(zhì)細胞的產(chǎn)生,新的細胞因子在神經(jīng)元上有受體。小膠質(zhì)細胞激活后,釋放炎性因子,如IL-1β和TNF等因子已被公認。小膠質(zhì)細胞的激活亦受到來自神經(jīng)元和其他膠質(zhì)細胞的細胞因子調(diào)節(jié)。細胞因子可能成為神經(jīng)元與小膠質(zhì)細胞間通訊的橋梁之一。據(jù)報道,將神經(jīng)元加到有小膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)液中,靜息狀態(tài)的小膠質(zhì)細胞被激活,并延長了神經(jīng)元的存活和增強軸突的生長,兩種細胞的接觸是相互作用的最重要因素。已知免疫刺激可引起下丘腦-垂體-腎上腺軸和交感神經(jīng)系統(tǒng)的活動增強。Yang等觀察到腹腔注射LPS,PVN中對免疫刺激起反應(yīng)的神經(jīng)元中有7