第十章反芻動物營養(yǎng)實驗技術-圖文第一節(jié)人工瘤胃技術一.人工瘤胃技術概述人工瘤胃技術是體外研究瘤胃微生物營養(yǎng)與代謝的一類技術方法，又稱瘤胃模擬培養(yǎng)法。由于人工瘤胃技術不受試驗動物的限制，可以在常規(guī)實驗室條件下進行研究，因此得到了越來越廣泛的應用。早期的人工瘤胃技術主要應用于較簡單的研究目的。如Woodman和Evan(1938)，通過體外瘤胃發(fā)酵證實纖維素在瘤胃內(nèi)降解的唯一中間產(chǎn)物是葡萄糖，終產(chǎn)物是VFA和乳酸。Quin（1943）用體外法研究了不同碳水化合物瘤胃發(fā)酵的產(chǎn)氣量。Pearon和Smith（1943）用體外法研究了瘤胃微生物對尿素的利用等。McDougall（1948）關于綿羊唾液礦物質(zhì)組成的研究在人工瘤胃技術發(fā)展史上具有重要意義，之后的各種人工瘤胃系統(tǒng)人工唾液的配制均參照了McDougall的研究結(jié)果。早期的人工瘤胃發(fā)酵裝置比較簡單，不少裝置僅是在厭氧的條件下對瘤胃液進行簡單的培養(yǎng)。由于發(fā)酵產(chǎn)物在系統(tǒng)內(nèi)的不斷積累，這類系統(tǒng)不能用于要求長時間發(fā)酵的研究工作，通常有效的發(fā)酵時間為12～24小時。Louw于1949年設計了一套帶有透析系統(tǒng)的人工瘤胃裝置，將瘤胃液和底物放入滲析袋或半透膜中，然后懸浮在緩沖液內(nèi)。該裝置在一定程度上將底物和發(fā)酵終產(chǎn)物分離開，延長了有效發(fā)酵時間。二十世紀五十年代至六十年代，人工瘤胃技術在牧草有機物和纖維素瘤胃降解研究方面得到了大量應用。用人工瘤胃技術研究的內(nèi)容包括不同牧草以及牧草與純纖維體外降解速度比較；牧草顆粒大小對體外降解速度的影響；體外評定牧草營養(yǎng)價值；用體外牧草發(fā)酵測定結(jié)果預測體內(nèi)發(fā)酵等。這一階段的人工瘤胃裝置也趨于復雜，以更加接近瘤胃發(fā)酵的真實情況。如Donfer使用的發(fā)酵裝置由32個發(fā)酵瓶組成，每個發(fā)酵瓶的容積為90ml，裝入的發(fā)酵液容量為50ml。每個瓶均有進氣口和出氣口，以每分鐘160個氣泡的速度向瓶內(nèi)通入二氧化碳。二十世紀七十年代，隨著反芻動物蛋白質(zhì)營養(yǎng)研究的深入，人工瘤胃技術開始應用于飼料蛋白質(zhì)的瘤胃降解率評定。1972年，BenBraver發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)法中的氨濃度與瘤胃內(nèi)氨濃度有很好的相關，并用短期培養(yǎng)法對飼料蛋白質(zhì)的瘤胃降解率進行了評定。Monhadeva（1979）、Broderik（1978，1979）用短期培養(yǎng)法評定了飼料蛋白質(zhì)的瘤胃降解率和微生物蛋白的產(chǎn)量。Road（1983）根據(jù)瘤胃產(chǎn)氣量與氨利用量之間的關系，用能量、微生物蛋白合成量計算了飼料蛋白質(zhì)的降解率。我國的吳毓群（1988），任鵬（1989）等分別用短期發(fā)酵法和持續(xù)發(fā)酵法測定了飼料蛋白質(zhì)與干物質(zhì)的降解率。二十世紀八十年代后期，人工瘤胃技術的應用范圍擴展到研究營養(yǎng)物質(zhì)對瘤胃微生物合成量的影響及營養(yǎng)物質(zhì)的匹配關系。這方面的研究因難以控制瘤胃內(nèi)環(huán)境而不能在體內(nèi)進行，例如進行瘤胃NH3濃度與瘤胃微生物合成量關系的研究由于瘤胃和動物本身對NH3濃度有調(diào)節(jié)作用，這樣就不能根據(jù)不同NPN在瘤胃內(nèi)NH3濃度的差異和消失速度判斷NPN的優(yōu)劣。人工瘤胃技術由于容易實現(xiàn)試驗條件的控制而具有體內(nèi)法不可比擬的優(yōu)越性。這一時期人工瘤胃裝置以可控性持續(xù)動態(tài)發(fā)酵的模擬裝置為主，中國農(nóng)業(yè)大學自行研制的RSⅠ—Ⅱ型瘤胃持續(xù)動態(tài)模擬裝置即屬此類型。二.短期人工瘤胃發(fā)酵裝置測定瘤胃產(chǎn)氣量短期人工瘤胃發(fā)酵裝置可以根據(jù)研究目的進行不同的設計，其共同特點是靜態(tài)發(fā)酵，不對底物和產(chǎn)物進行分離，因而只能持續(xù)較短的時間。但試驗裝置簡單，在飼料營養(yǎng)價值評定等研究方面仍具有很大的價值。下面介紹英國Rowett研究所用于測定瘤胃微生物產(chǎn)氣量的人工瘤胃技術，其主要用途是研究不同粗飼料及添加劑等對飼料瘤胃降解及甲烷氣能損失的影響。人工唾液的制備：人工唾液由蒸餾水、礦物質(zhì)元素溶液、微量元素溶液、刃天青（reazurin）溶液混合而成。將混合溶液置于三角瓶中，水浴加熱至39℃之后加入還原液。將以上混合溶液置于39℃磁力攪拌器上不斷攪拌，同時通入CO2氣泡，直至溶液顏色由藍變至粉紅最后變?yōu)闊o色透明，表明人工唾液已呈還原狀態(tài)。升高CO2通氣管至液面以上，并連續(xù)通入CO2，調(diào)整PH值至7.0～7.30。礦物質(zhì)溶液:Na2HPO45.7gKH2PO46.2gMgSO40.6g加蒸餾水至1升微量元素溶液:CaCl2·2H2O16.12gMnCl2·4H2O10.0gCoCl2·6H2O1.0gFeCl2·6H2O0.8g加蒸餾水至1升緩沖溶液（PH7.0～7.3）:NaHCO335g（NH4）HCO34g加蒸餾水至1升刃天青溶液:100mg/100ml人工唾液:蒸餾水礦物質(zhì)溶液緩沖液微量元素溶液刃天青還原溶液蒸餾水1MNaOHNa2S9·H2O(mg)23.81.016847.52.033671.33.050495.04.067250023.75120.0120.00.060.61最終容積（ml）1000475240.0240.00.121.221500712.5360.0360.00.181.832000950.0480.0480.00.242.44瘤胃液制備：抽取瘤胃液（一般從2-3只試驗動物抽取并混合，經(jīng)三層紗布過濾）。將瘤胃濾液加入到人工唾液中，人工唾液與瘤胃濾液的體積比例為2:1。發(fā)酵管的制備：發(fā)酵管可以選用50～100ml的玻璃注射器，上有刻度。稱取200mg待測樣品加入每一個發(fā)酵管中，并準確記錄加入的待測樣品重量。抽入30ml瘤胃液，排出空氣后用橡皮帽封口。置入39℃水溶搖床上發(fā)酵?？瞻讓φ展軆H加入瘤胃液，不加待測樣品，以校正產(chǎn)氣管。對于化學物質(zhì)等對產(chǎn)氣量的影響研究還應加入不含化學物質(zhì)而僅含待測樣品和瘤胃液的對照。對粗飼料，讀產(chǎn)氣量數(shù)據(jù)的時間為3，6，12，24，48，72小時；對于精飼料，24小時內(nèi)的讀數(shù)次數(shù)應適當增加。開始發(fā)酵的前24小時內(nèi)應輕輕混勻發(fā)酵管內(nèi)容物2-3次。三.持續(xù)動態(tài)人工瘤胃發(fā)酵系統(tǒng)持續(xù)動態(tài)人工瘤胃發(fā)酵系統(tǒng)的結(jié)構較為復雜，可以應用于常規(guī)飼料營養(yǎng)價值評定、蛋白質(zhì)飼料瘤胃保護技術、各種化學試劑和藥物對微生物代謝影響及瘤胃營養(yǎng)調(diào)控等方面的研究。由于應用持續(xù)動態(tài)人工瘤胃系統(tǒng)進行的研究通常要求持續(xù)發(fā)酵的時間為2-10天，因此需要對整個系統(tǒng)的技術條件有一個嚴格的要求，以接近瘤胃發(fā)酵的真實情況。⒈持續(xù)動態(tài)人工瘤胃發(fā)酵系統(tǒng)的技術指標1.1瘤胃液與人工唾液的比例：以1:1較為理想，隨著人工唾液比例的增加，發(fā)酵液的PH增大，NH3濃度下降。1.2外流速度：早期的持續(xù)動態(tài)人工瘤胃裝置固相和液相的外流速度相同，后來認識到這與瘤胃內(nèi)容物的排空情況不一致。Hoover等（1991）在總結(jié)相關研究工作的基礎上提出，持續(xù)動態(tài)人工瘤胃裝置的液相外流速度以0.12%/h、固相外流速度以0.042%/h為好。在實際應用過程中最好根據(jù)研究目的，通過試驗確定。1.3溫度：對系統(tǒng)的發(fā)酵溫度控制一定要準確，即使0.5℃的差異也會對結(jié)果產(chǎn)生明顯的影響。由于瘤胃微生物對高溫特別敏感，應特別注意發(fā)酵溫度不超過40℃，即使在40℃下經(jīng)過較長時間，也可觀察到活性下降。適宜的發(fā)酵溫度為39℃。1.4PH值：用于提取瘤胃微生物的動物，其日糧應根據(jù)研究目的而定。如以淀粉的瘤胃降解為研究目的，動物的日糧中應含有較高比例的淀粉。瘤胃微生物可以從瘤胃液制備，也可以從瘤胃內(nèi)容物制備。從瘤胃液制備時，用硬質(zhì)塑料管從瘤胃的不同部位吸取瘤胃液，過濾后備用。從瘤胃內(nèi)容物制備時，取瘤胃內(nèi)容物置入盛有生理鹽水的塑料袋中，用力拍打后過濾，濾液備用。如以獲得微生物的最大活力為目的，可將瘤胃液直接加入系統(tǒng)中；如研究目的為測定微生物的養(yǎng)分需要量，則應向系統(tǒng)中加入提取的瘤胃微生物。⒊維持厭氧狀態(tài)：發(fā)酵系統(tǒng)應有良好的氣密性，以防止空氣進入。發(fā)酵開始前向系統(tǒng)中通入CO2和N2的混合氣體（CO295%+N25%），以排除原有空氣。發(fā)酵過程中的厭氧狀態(tài)可以通過不斷通入CO2（40m2/min）來維持，氣密性良好的情況下也可靠發(fā)酵過程中產(chǎn)生的CO2來維持。⒋攪拌：在持續(xù)發(fā)酵裝置中可以通入的CO2起到攪拌的作用，也可由電機（6-7轉(zhuǎn)/分）或磁力攪拌器進行攪拌。發(fā)酵系統(tǒng)的攪拌不易太劇烈，有研究表明劇烈攪拌對纖維素的降解有不利影響。⒌氧化還原電位（Eh）：在厭氧環(huán)境中，不斷積累的還原性物質(zhì)使發(fā)酵系統(tǒng)的還原性不斷增強。在瘤胃內(nèi)通過產(chǎn)生烷排除多余的電子對，將瘤胃液的Eh維持在-350-500μV之間。對于持續(xù)發(fā)酵的人工瘤胃系統(tǒng)可以通過加入還原劑調(diào)節(jié)Eh，常用的還原劑有硫化銅、維生素C及半胱氨酸和胱氨酸等。四.持續(xù)動態(tài)人工瘤胃發(fā)酵系統(tǒng)RSⅠ—ⅡRSⅠ—Ⅱ是中國農(nóng)業(yè)大學動物科技學院馮仰廉主持研制的持續(xù)動態(tài)系統(tǒng)。該系統(tǒng)吸收了短期發(fā)酵裝置和尼龍袋為固相的長期發(fā)酵裝置（Ruitec）的優(yōu)點，進行試驗研究的重復性好，不同試驗周期和不同發(fā)酵罐間測定結(jié)果的變異系數(shù)一般小于5%。該系統(tǒng)在模擬瘤胃內(nèi)環(huán)境方面做到了非均一性，即在讓飼料與發(fā)酵測定混合的同時，可以模擬瘤胃內(nèi)飼料自然分層的現(xiàn)象。發(fā)酵罐的喂料量和喂料次數(shù)可