微生物檢驗的質(zhì)量保證

p63一.概述質(zhì)量控制（qualitycontrol）：是臨床微生物學(xué)實驗室為了保證檢驗結(jié)果實事求是地反映客觀存在而建立的操作程序體系。質(zhì)量保證（qualityassuranceQA）：是有計劃、系統(tǒng)地評估和檢測患者診療質(zhì)量的整個過程，以便及時發(fā)現(xiàn)問題，采取有效措施，提高質(zhì)量和服務(wù)。1.質(zhì)控的意義：保證檢驗結(jié)果的準確，避免操作誤差造成誤診或漏診。2.質(zhì)控的內(nèi)容：包括培養(yǎng)基、所用儀器、試劑、抗生素、標準菌株、操作過程等進行質(zhì)量控制。3.質(zhì)控的分類：包括室內(nèi)質(zhì)控和室間質(zhì)控。室內(nèi)質(zhì)控是由實驗室內(nèi)部制定并實施的，是質(zhì)量保證的核心和基礎(chǔ)；室間質(zhì)控是由實驗室外部的組織或機構(gòu)對實驗室進行的質(zhì)量評價。4.微生物室質(zhì)量控制的環(huán)節(jié)檢驗前：標本留取運送檢驗中：標本合格判定，培養(yǎng)基，試劑，儀器設(shè)備檢驗后：結(jié)果報告檢驗申請患者姓名、出生日期、病房和床號、年齡和性別臨床表現(xiàn)及當(dāng)前所用抗菌藥物相關(guān)旅行史標本來源檢驗項目感染類型或目標微生物標本采集時間、實驗室收到標本時間

檢驗前質(zhì)量保證標本的采集原始標本采集手冊，包括患者準備不同部位標本的采集方法標本運送要求延遲運送時標本的貯藏方法安全運送標本的方法標本標識

標本采集指南應(yīng)方便標本采集、運送者取閱標本的運送與接收標本運送：根據(jù)申請檢驗項目的性質(zhì)；標本采集指南規(guī)定的運送時間、運送條件、運送培養(yǎng)基。標本接收：制定并執(zhí)行標本接收或拒收標準，包括合適的標本類型、標本量、運送條件、預(yù)防拭子干燥、運送培養(yǎng)基等。缺乏正確標識的標本：一般不接收或處理；

檢驗中質(zhì)量保證

(一)對檢驗人員的要求：

廣泛的基礎(chǔ)教育，專業(yè)化的實驗技能培訓(xùn)，有經(jīng)驗的微生物學(xué)家監(jiān)督的日常嚴格訓(xùn)練。對不斷涌入的新技術(shù)、新知識不斷地學(xué)習(xí)。此外還要有高度的責(zé)任心和高尚的醫(yī)德。人員要求：負責(zé)人：本科，中級，五年檢驗員：本科相關(guān)專業(yè)臨床微生物檢驗技術(shù)培訓(xùn)——資格證新進人員：資格證人員配置：高中初級職稱各級檢驗人員人員培訓(xùn)及考核:每年人員管理：建立技術(shù)檔案簡言之，檢驗人員應(yīng)業(yè)務(wù)水平高，工作態(tài)度好。實驗室的管理：

應(yīng)至少有一名經(jīng)嚴格訓(xùn)練并長期從事以微生物檢驗的技術(shù)人員，全面負責(zé)實驗室的工作，指導(dǎo)下級技術(shù)人員，并與臨床醫(yī)師和護理人員經(jīng)常接觸，向他們傳輸微生物知識。實驗室設(shè)置標本接種，細菌鑒定和藥敏，培養(yǎng)基配置等崗位污染區(qū)，半污染區(qū)，清潔區(qū)實驗室管理微生物實驗室的生物安全制度《二級生物安全防護程序》實習(xí)，進修，非本實驗室人員清潔消毒污染處理實驗室質(zhì)量管理，生物安全管理，人力資源管理《實驗室安全管理程序》《室間質(zhì)量控制管理程序》《室內(nèi)質(zhì)量控制管理程序》《實驗室人員的配置及培訓(xùn)程序》《工作人員職責(zé)設(shè)置程序》

此外，實驗室內(nèi)必須具備一本根據(jù)本實驗室條件編寫的標準操作手冊，使之成為全體工作人員操作時共同遵守的標準程序，不得隨意更改或簡化。包括內(nèi)容有：①各級人員的職責(zé)和權(quán)限②實驗室安全措施③標本采集和處理措施④開展項目和最低鑒定要求⑤培養(yǎng)基和試劑的配制方法⑥質(zhì)量控制方案⑦常用參考數(shù)值⑧其他制度二.試劑、抗血清和染色液的質(zhì)量控制1).試劑及染色液：用于測定細菌各種生物學(xué)特性的試劑，必須注明配制或購入的日期，并注意有效日期以及貯存條件。由于試劑的穩(wěn)定性不一致，有時須在測試同時進行陽性和陰性對照。Eg:新鮮血漿，3%過氧化氫，甲基紅，V-PEg:革蘭染色液—金葡，大腸2).抗血清的質(zhì)量控制：抗血清的來源必須可靠。并根據(jù)制造者的使用說明，使用與保存。凍干制品-水溶液時間。已知菌效價和特異性檢測。3.抗生素與抗生素紙片1).紙片擴散法的質(zhì)量控制A.培養(yǎng)基：MH瓊脂，每批新購入的MH瓊脂應(yīng)使用標準菌株、已知在控的藥敏紙片和標準方法進行測試。ATCC25923、ATCC25922接種于MH培養(yǎng)基上，35℃溫箱24-48h培養(yǎng)，細菌生長良好。HTM，GC，MH加脫纖維羊血。

4mm厚度（100mm平板倒25-30ml）35℃孵育30min，ph=7.2-7.4，普通儲存條件（2℃-8℃）可以使用7天。

B.菌懸液濃度標準：常規(guī)用于紙片擴散法的菌懸液濃度為1.5×108CFU/ml，相當(dāng)于0.5管麥氏濁度標準管。濁度標準管應(yīng)按規(guī)定配制，并用分光光度計在625nm處測定吸光度指為0.08~0.10，為符合標準。每月更換標準管。使用前用旋渦混合儀劇烈震蕩混勻后使用。

C.

含藥紙片：以冷凍干燥法制備的質(zhì)量最好，每張紙片的含藥量要一致。使用前應(yīng)置室溫平衡1~2h，防止紙片表面產(chǎn)生冷凝水，用畢及時冷藏或冷凍保存。-20℃可以保存一年，少量正在應(yīng)用的紙片可以在2℃-8℃保存一周。新購入的含藥紙片每批用標準菌株和在控培養(yǎng)基，用標準方法進行測定。D.實驗過程及結(jié)果測量

配制好的菌懸液應(yīng)在15min內(nèi)接種至MH平板接種后的平板應(yīng)在室溫平放3~5min，使平板表面的多余水分吸收。然后將預(yù)先確定的抗微生物藥物紙片貼到平板上，各紙片之間的中心距離不少于24㎜，于平皿邊緣的距離不少于15㎜。

紙片一旦接觸瓊脂表面，不應(yīng)再移動位置。貼好紙片的平板應(yīng)在15min內(nèi)翻轉(zhuǎn)，置35℃孵育箱中18~24h。平板最多2只疊放在一起，以保證整個平板受熱均勻。結(jié)果的測量應(yīng)使用帶表卡尺或精確度達1/10㎜的其它量具。

E.質(zhì)控菌株：用于紙片擴散法的質(zhì)控菌株有：金黃色葡萄球菌ATCC25923；大腸埃希菌ATCC25922；銅綠假單胞菌ATCC27853。流感嗜血桿菌ATCC49247（用于HTM培養(yǎng)基），淋球菌ATCC49226（GC瓊脂）肺鏈ATCC49619（用于5%羊血的MH培養(yǎng)基）

F.抑菌環(huán)的質(zhì)控范圍：每一種含藥紙片對標準質(zhì)控菌株測定的結(jié)果應(yīng)符實驗指導(dǎo)附錄中所列的范圍，這些范圍有95%的可信區(qū)間，連續(xù)20個試驗的結(jié)果中，任何有一個以上的結(jié)果超出即認為失控。

G.質(zhì)控測定次數(shù)：每批新的MH瓊脂和含藥紙片必須用質(zhì)控菌株進行檢測。繼而每天與常規(guī)標本一起測定質(zhì)控菌株以監(jiān)控整個操作過程。

在符合以下條件時可減少測定次數(shù)：①與常規(guī)標本一起連續(xù)測定質(zhì)控菌株30日；②每種藥物與相應(yīng)的每種細菌的30個抑菌環(huán)直徑只有少于3個結(jié)果超出附錄所列的范圍。

達到以上要求以后，可執(zhí)行每周一次檢測，如發(fā)現(xiàn)有一個不符和結(jié)果，應(yīng)立即尋找原因加以糾正，如不能發(fā)現(xiàn)原因，則須立即改為每日檢測。紙片擴散法常見的錯誤原因：質(zhì)控結(jié)果記錄錯誤量取抑菌環(huán)直徑讀數(shù)錯誤標準菌株被污染或其他改變接種的菌懸液過濃或過淡0.5管麥氏濁度標準管未搖勻或失效孵育溫度或氣體環(huán)境不正確MH培養(yǎng)基質(zhì)量問題含藥紙片失效2).稀釋法A.培養(yǎng)基：應(yīng)使用MH肉湯，PH為7.2~7.4，并將Ca2+濃度調(diào)節(jié)至25mg/L，Mg2+濃度調(diào)節(jié)至10~12.5mg/L。銅綠假單胞菌ATCC27853株對慶大霉素的MIC測定值比規(guī)定的預(yù)期值低則應(yīng)添加Ca2+、Mg2+B.抗微生物藥：標準品或參考品可來自國家權(quán)威鑒定機構(gòu)，也可來自生產(chǎn)廠家提供的表明效價的標準品或參考品。C.接種量：在液體培養(yǎng)基中不宜大量接種，因為極少數(shù)的耐藥菌生長將造成判斷錯誤。微量稀釋法為5X104

CFU/mlD.質(zhì)控菌株：用于稀釋法質(zhì)控的理想質(zhì)控參考菌株的MIC值應(yīng)落在一系列被測抗微生物藥物濃度的中間濃度附近。金黃色葡萄球菌ATCC25923對絕大多數(shù)抗微生物藥物極其敏感，因而不適宜用于稀釋法質(zhì)控。常用菌株：

大腸埃希菌ATCC25922、35218

銅綠假單胞菌ATCC27853

金葡ATCC29213、43300

流感嗜血桿菌ATCC49247、49766E.質(zhì)控MIC的允許范圍：見標準參考書目單一藥物對質(zhì)控菌株的MIC范圍。這些范圍有95%的可信區(qū)間，任何有一個以上的結(jié)果超出即認為失控。F.質(zhì)控測定次數(shù)同紙片擴散法。三.培養(yǎng)基的質(zhì)量控制1）原材料的挑選：應(yīng)挑選各成分較穩(wěn)定的試劑，各種化學(xué)試劑一般應(yīng)選用分析純。2）

配制過程：按照實驗室內(nèi)操縱手冊中培養(yǎng)基的配制方法、配制步驟和注意事項嚴格進行。3).一般質(zhì)量控制A.

外觀：每種培養(yǎng)基應(yīng)標注清楚。培養(yǎng)基應(yīng)澄清、無渾濁，有濃度要求的培養(yǎng)基應(yīng)觀察失水情況。B.

無菌試驗：應(yīng)對每批培養(yǎng)基的滅菌效果進行檢測。C.

培養(yǎng)基的量：一般而言，斜面培養(yǎng)基的長度不超過試管的2/3；雙糖鐵培養(yǎng)基底層至少有1cm的直立段；MH平板的厚度應(yīng)為4㎜；其他平板厚度一般為3㎜。D.

PH：配制完成的培養(yǎng)基PH應(yīng)與規(guī)定的PH相差±0.2之內(nèi)，應(yīng)在室溫條件下用PH計法測定。

E.性能試驗：每一批新配制的、新購入的培養(yǎng)基，無論是分離，選擇和鑒別培養(yǎng)基，均應(yīng)用已知性質(zhì)的標準菌株進行預(yù)測。用于測試分離培養(yǎng)基性能的菌株，原則上應(yīng)使用預(yù)期最難生長的細菌菌種，并應(yīng)少量接種。Eg:

四.儀器A.高壓滅菌和干熱滅菌器：最好安裝溫度記錄裝置。生物指示劑（嗜熱脂肪芽胞桿菌ATCC7953、12980的培養(yǎng)液或菌片）化學(xué)指示劑物理指征（定點溫度計＞1210C）等監(jiān)視滅菌效果。新購產(chǎn)品，大容量滅菌器。B.培養(yǎng)箱、冰箱、水浴箱：應(yīng)在每日工作開始和結(jié)束時記錄溫度。C.二氧化碳培養(yǎng)箱：須每日檢查箱內(nèi)的CO2含量，可用CO2測量儀，也可用血氣分析儀測定?；蛴媚紊L試驗。D.厭氧罐或厭氧箱：在罐中或厭氧箱內(nèi)用美藍或刃天青作為指示劑，無氧時均無色。E.生物安全柜：若須更換濾網(wǎng)，則須由專門技術(shù)員人員進行。紫外線三月一檢。F.細菌培養(yǎng)儀：對每批號培養(yǎng)瓶須進行少量生長試驗。保證在有效期內(nèi)使用。對儀器的每個瓶位須定期進行校正，保證應(yīng)有的靈敏度。G.微生物鑒定儀：應(yīng)及時更新系統(tǒng)操作軟件，使之能識別最新認識的微生物。五.標本檢驗過程的質(zhì)量控制1).檢驗項目的申請、標本采集和運送

臨床醫(yī)師應(yīng)準確把握檢驗項目的適用范圍、標本采集時機和結(jié)果的臨床意義，選擇合理的檢驗項目和適當(dāng)?shù)臉吮舅蜋z，正確書寫檢驗申請單。

微生物學(xué)實驗室在收到標本后，核對申請單上內(nèi)容和所送標本是否相符，送檢的標本是否符合微生物學(xué)檢驗要求。如果不符，應(yīng)注明理由退回。

2).直接診斷A.對膿、腦脊液、胸腹水等無菌部位來的標本，可直接發(fā)現(xiàn)病原體，可作為初步報告給臨床醫(yī)師。B.對痰標本的涂片檢查，可確定標本是否合格，并可發(fā)現(xiàn)病原體。C.對尿液標本的涂片檢查，可發(fā)現(xiàn)病原體并進行初步計數(shù)，為直接藥敏試驗奠定了基礎(chǔ)。D.給下一步培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法的選擇提供了信息。3).分離培養(yǎng)和鑒定A.分離培養(yǎng)：使用多種適合于可疑病原菌生長的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，或根據(jù)標本直接涂片選擇不同的培養(yǎng)方法。B.鑒定：按鑒定程序執(zhí)行，不可省略菌落形態(tài)觀察和涂片染色鏡檢。六、

標準菌株的來源和保存1).標準菌株的來源：標準菌株是指具有典型的、穩(wěn)定的生理生化特征，并被國際社會所認可的菌株。衛(wèi)生部藥物生物制品鑒定所菌株保藏中心，美國菌種保藏中心（ATCC）、NTCT等。各級臨床檢驗中心下發(fā)的質(zhì)控菌株也可作為實驗室質(zhì)控用的具有一定的標準菌株。2).標準菌株的保存A.一般保存法：是最簡單的菌種保存方法，適合大多數(shù)實驗室，將細菌種于半固體培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)18-24h后封蓋1cm厚的無菌石蠟油，置4℃保存。B.冷凍干燥法：為最可靠的菌種保藏方法，具有不改變菌種性狀和保存時間長等優(yōu)點，但需有專門的冷凍干燥設(shè)備。三.室間質(zhì)量控制(一)機構(gòu)

我國負責(zé)臨床微生物實驗室質(zhì)量控制的部門是各級臨床檢驗中心和參考實驗室，負責(zé)定期或不定期地通過各項熟練程度考核和盲點試驗檢查各實驗室的工作質(zhì)量水平，進行總結(jié)和評估，針對各個薄弱環(huán)節(jié)，舉辦各種培訓(xùn)班，以便提高技術(shù)人員的水平。

各級實驗室可同時接受國內(nèi)、國際多個質(zhì)量控制機構(gòu)或參考實驗室的質(zhì)量評價。(二)內(nèi)容和方法1.室間質(zhì)量控制的一般性檢查項目1).培養(yǎng)基和試劑的配制記錄、培養(yǎng)基的保存方法、滅菌質(zhì)量、有效期。2).室內(nèi)全面質(zhì)量控制的建立，室內(nèi)工作人員的熟練程度的考核和盲點試驗的進行情況，細菌檢驗操作的規(guī)范性。3).設(shè)備的操作卡，操作人員的操作水平，設(shè)備的使用、保養(yǎng)、維修記錄。

2.熟練程度的考核由質(zhì)控管理機構(gòu)發(fā)放模擬標本或菌種，接收的實驗室知道菌種的來源、檢驗的內(nèi)容和時間。實驗室完成鑒定后在規(guī)定的時間內(nèi)將結(jié)果反饋至檢驗中心或參考實驗室，進行評價。3.盲點試驗

為了準確反映受控實驗室日常處理臨床標本的實際能力，較好的方法是進行未知標本的盲點質(zhì)量控制（qualitycontrolblindunknow）。由質(zhì)控管理機構(gòu)將模擬標本混入臨床普通標本，送入實驗室進行常規(guī)測定。

實驗室主管及實驗操作者不知哪一個標本是來自質(zhì)控結(jié)構(gòu)的。實驗結(jié)果由質(zhì)控管理機構(gòu)負責(zé)收回，進行評價。（三）質(zhì)控結(jié)果的分析與評價

質(zhì)控管理機構(gòu)對每次質(zhì)控結(jié)果進行統(tǒng)計分析，將每一實驗室的結(jié)果與標準進行比較。根據(jù)參加的規(guī)模和鑒定的正確數(shù)，計算鑒定正確率及所有參加實驗室的平均分，以及每個實驗室的得分。評分方法各有不同，美國以百分制計算。世界衛(wèi)生組織對每一個正確的鑒定得3分，部分正確但可以接受的鑒定結(jié)果得2分，鑒定結(jié)果部分錯誤得1分，完全錯誤得0分。對調(diào)查結(jié)果的統(tǒng)計分析和評估1.絕對計分法（US）正確菌株數(shù)正確率（%）=×100%