基于sbasa方法的近交系小鼠snp數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建

自jenon在上個(gè)世紀(jì)第一次應(yīng)用封閉繁殖的小鼠系列以來(lái)，幾乎沒有成功轉(zhuǎn)移到腫瘤（尤其是腫瘤）動(dòng)物的醫(yī)學(xué)研究以來(lái)，近交系實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（尤其是腫瘤研究）具有潛在的價(jià)值。爾后,關(guān)于培育近交系動(dòng)物的理論及實(shí)踐工作得到了較快的發(fā)展。高度近交系實(shí)驗(yàn)動(dòng)物能為生物學(xué)、醫(yī)學(xué)及農(nóng)業(yè)科研工作提供敏感、特異性強(qiáng)和重復(fù)性好的試驗(yàn)材料。目前,已培育出了大量的小鼠、大鼠、地鼠、豚鼠、家兔、雞等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的近交系。在我國(guó),隨著生物科學(xué)的發(fā)展,培育大量的、具有各種特殊用途的、符合遺傳質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)近交系實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,滿足科學(xué)研究的需要,已經(jīng)刻不容緩。對(duì)于近交系小鼠,在從國(guó)外不斷引進(jìn)的同時(shí),我國(guó)也先后培育出一些具有一定特征的品系,并逐步應(yīng)用于各個(gè)科學(xué)領(lǐng)域。近交系小鼠具有同基因性、長(zhǎng)期遺傳穩(wěn)定性、均一性、個(gè)體性、背景資料和數(shù)據(jù)較完善等特點(diǎn),隨著生命科學(xué)的不斷發(fā)展,對(duì)其遺傳品質(zhì)要求越來(lái)越高。傳統(tǒng)的小鼠遺傳檢測(cè)方法有形態(tài)學(xué)方法、免疫學(xué)方法、生物化學(xué)方法。隨著一系列分子遺傳標(biāo)記的發(fā)現(xiàn),產(chǎn)生了分子生物學(xué)檢測(cè)方法,應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳檢測(cè),如基于限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)、隨機(jī)引物多態(tài)性(RandomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)、微衛(wèi)星(Microsatellite)和DNA指紋(DNAFingerprints)等。近來(lái)單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)技術(shù)也被用于近交系小鼠遺傳質(zhì)量檢測(cè),并建立了近交系小鼠的SNP數(shù)據(jù)庫(kù);但目前國(guó)內(nèi)主要采用皮膚移植法和生化標(biāo)志基因檢測(cè)方法,因此國(guó)內(nèi)培育的近交系小鼠的遺傳背景也只是生化標(biāo)志基因方面。我們最近建立了單管雙向等位基因?qū)Ｒ恍詳U(kuò)增(single_tubebi_directionalallelespecificamplification,SB_ASA)方法,用于檢測(cè)SNP位點(diǎn),本文旨在用SB_ASA方法檢測(cè)國(guó)內(nèi)近交系小鼠,確定SNP位點(diǎn)等位基因型,從而為國(guó)內(nèi)近交系小鼠的SNP數(shù)據(jù)庫(kù)填補(bǔ)空白。1材料和方法1.1制備近交系小鼠dna采用酚:氯仿抽提法從鼠尾中提取了NCPC/2、NCPC/4、TA1、615等4個(gè)近交系小鼠品系DNA,所有品系均引自北京國(guó)家嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心,經(jīng)遺傳生化位點(diǎn)檢測(cè)為合格的近交系小鼠。1.2pcr和vectors試劑DNA片段純化試劑盒、限制型內(nèi)切酶EcoRI、DNA聚合酶等PCR試劑購(gòu)自寶生物公司(大連),pGEM_TEasyVectorSystem購(gòu)自Promega公司。1.3cu-p3小鼠snp位點(diǎn)等位基因型的構(gòu)建針對(duì)每個(gè)SNP位點(diǎn),設(shè)計(jì)4個(gè)引物P1、MSP1、MSP2和P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增,P1和MSP2、MSP1和P2分別擴(kuò)出長(zhǎng)度相差100bp以上的特征片段,而P1和P2在所有品系小鼠中擴(kuò)增出一條可作為內(nèi)對(duì)照的長(zhǎng)片段。根據(jù)特征片段長(zhǎng)度的差異,我們可以很容易地判斷出各品系小鼠的SNP位點(diǎn)等位基因型。我們已經(jīng)成功地建立了25μLPCR反應(yīng)體系及其程序,PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果在紫外燈下照相記錄,用生物電泳成像系統(tǒng)分析,根據(jù)凝膠上電泳條帶判斷SNP類型。1.4gemt價(jià)值用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收純化目的片段,然后連接于pGEM_TEasyVector,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,涂布在有氨芐抗性的固體培養(yǎng)基中,過(guò)夜培養(yǎng),挑單克隆搖菌過(guò)夜培養(yǎng),提取質(zhì)粒,EcoRⅠ酶切驗(yàn)證,菌液送大連寶生物公司測(cè)序。2結(jié)果2.1利用加標(biāo)回波加加低速率降解snp對(duì)16個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行了檢測(cè),雖然某些位點(diǎn)引物二聚體、錯(cuò)配雜帶現(xiàn)象仍存在,但是不影響SNP檢測(cè)結(jié)果。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳圖譜(圖1)可以看出,每個(gè)位點(diǎn)都擴(kuò)增出3條目的片段,即一條所有品系都有的片段,由引物P1、P2擴(kuò)增而得,起內(nèi)對(duì)照的作用;兩條特征片段,分別對(duì)應(yīng)于不同的等位基因,根據(jù)特征片段的差異,可以很容易地確定每個(gè)品系的SNP位點(diǎn)等位基因。通過(guò)對(duì)多個(gè)SNP位點(diǎn)的檢測(cè),可以建立每個(gè)小鼠品系的SNP位點(diǎn)等位基因圖譜,為各小鼠品系的遺傳鑒定和品系間的鑒別提供了有利的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),從而為近交系小鼠遺傳檢測(cè)提供了更加準(zhǔn)確的遺傳背景資料,表1為本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的4個(gè)近交系小鼠16個(gè)SNP位點(diǎn)的等位基因型。2.2確定snp位點(diǎn)等位基因型根據(jù)電泳圖中特征片段長(zhǎng)度的差異,我們成功地對(duì)4個(gè)近交系小鼠16個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行了檢測(cè),確定了SNP位點(diǎn)等位基因型;同時(shí)我們對(duì)其中的每條特征片段都進(jìn)行了測(cè)序驗(yàn)證,測(cè)序結(jié)果顯示其SNP等位基因型與SB_ASA方法檢測(cè)的結(jié)果完全一致,說(shuō)明了SB_ASA方法的可靠性,同時(shí)確定了SNP位點(diǎn)等位基因型。3新品系小鼠snp的檢測(cè)位點(diǎn)對(duì)單管雙向等位基因?qū)Ｒ恍詳U(kuò)增(SB_ASA)檢測(cè)近交系小鼠SNP的可靠性我們作了考察。通過(guò)對(duì)5個(gè)國(guó)外近交系小鼠的16個(gè)SNP位點(diǎn)檢測(cè),結(jié)果其SNP位點(diǎn)等位基因均與國(guó)外報(bào)道的SNP數(shù)據(jù)庫(kù)一致,通過(guò)測(cè)序也得到了驗(yàn)證,而且雙盲實(shí)驗(yàn)通過(guò)3個(gè)SNP位點(diǎn)準(zhǔn)確地把5個(gè)品系相互區(qū)別。本實(shí)驗(yàn)對(duì)近交系小鼠的16個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行了檢測(cè),基本達(dá)到了國(guó)內(nèi)外遺傳檢測(cè)要求,但作為新品系的鑒定及科學(xué)研究,還需進(jìn)一步檢測(cè)更多的SNP位點(diǎn),以便提供更準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳概貌。目前國(guó)內(nèi)已經(jīng)培育了一系列新品系近交系小鼠,本實(shí)驗(yàn)只檢測(cè)了其中的4個(gè)品系,對(duì)于建立國(guó)內(nèi)近交系小鼠SNP數(shù)據(jù)庫(kù)而言顯然不夠,我們還需要對(duì)更多的國(guó)內(nèi)品系小鼠進(jìn)行檢測(cè),以備建立較完善的SNP數(shù)據(jù)資料。目前國(guó)際所規(guī)定的遺傳檢測(cè)方法是生化標(biāo)記分析法,這一方法是檢測(cè)同工酶或異構(gòu)蛋白酶的變化來(lái)推測(cè)相應(yīng)的基因變化,存在著準(zhǔn)確度及靈敏度低,檢測(cè)位點(diǎn)及反映遺傳概貌有限等弊端。SNP主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。SNP所表現(xiàn)的多態(tài)性只涉及到單個(gè)堿基的變異,具有密度高、代表性、遺傳穩(wěn)定性