細(xì)胞的體外培養(yǎng)儀器和設(shè)備細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件培養(yǎng)基的組成成分培養(yǎng)基的物理性質(zhì)(1)無菌條件：風(fēng)淋室、超凈臺、干燥除菌設(shè)備、低溫冰箱等。(2)細(xì)胞生長條件：純水蒸餾器、純水儀、CO2孵箱、培養(yǎng)器皿等。一.儀器和設(shè)備

風(fēng)淋室

超凈臺純水儀CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)瓶培養(yǎng)器皿培養(yǎng)板血清一般常用為小牛血清(包括胎牛血清),人血清和其它動物血清。二.培養(yǎng)基的組成成分氨基酸（必需氨基酸）谷氨酰胺是細(xì)胞合成核酸和蛋白質(zhì)必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺時，細(xì)胞生長不良而死亡。維生素維持細(xì)胞生長的生物活性物質(zhì)，在細(xì)胞代謝中起調(diào)節(jié)及控制作用。

碳水化合物細(xì)胞生長的主要能量來源其中有的是合成蛋白質(zhì)和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脫氧核糖、丙酮酸鈉和醋酸等。平衡鹽溶液主要用于稀釋和灌注的液體，維持細(xì)胞滲透壓，提供緩沖系統(tǒng)，使培養(yǎng)液的酸堿度維持在培養(yǎng)細(xì)胞生理范圍內(nèi)，提供細(xì)胞正常代謝所需的水分和無機離子等。抗生素常用為青霉素和鏈霉素、兩性霉素，以抑制革蘭氏陰性菌和陽性菌的污染。

氫離子緩沖器成纖維細(xì)胞生長因子表皮生長因子FGFEGF三.培養(yǎng)基的物理性質(zhì)PH大多數(shù)細(xì)胞在PH=7.4時生長最好，一般6.8--7.6。溫度溫度除直接影響細(xì)胞生長外，也與培養(yǎng)液的PH值有關(guān)。如：低溫時，CO2溶解多，影響PH值。PH指示劑粘度粘度對細(xì)胞生長影響較少，但在細(xì)胞培養(yǎng)或用胰蛋白酶處理時，為盡量減少細(xì)胞損傷

，可通過提高培養(yǎng)液粘度來克服。加羧甲基纖維素或聚乙烯吡咯烷酮來增加粘度。表面張力和泡沫表面張力有利于培養(yǎng)物粘著于底物上面。在懸浮培養(yǎng)中，減少泡沫的產(chǎn)生，加防泡沫硅。滲透壓細(xì)胞必須生活在等滲環(huán)境中，大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞對滲透壓有一定耐受性。原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)細(xì)胞的衰退細(xì)胞培養(yǎng)的類型一、細(xì)胞原代培養(yǎng)

從動物機體取出的進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞群。生長緩慢，繁殖一定的代數(shù)后（一般10代以內(nèi)）停止生長。

嚴(yán)格的說即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，但實際上，通常把第一代至第十代以內(nèi)的培養(yǎng)細(xì)胞統(tǒng)稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)

，隨不同的組織時間長短不一，一般為1-4周。此期細(xì)胞呈活躍的移動，可見細(xì)胞分裂但不旺盛。原代培養(yǎng)6天后的大鼠神經(jīng)元1.組織解離：1）胰蛋白酶解離細(xì)胞法:2）膠原酶解離細(xì)胞法3）機械解離細(xì)胞法2.細(xì)胞解離無菌條件下采取動物組織或器官，放在含有抗生素的平衡鹽溶液中，然后盡快在超凈臺內(nèi)進(jìn)行解離處理。｛解除了細(xì)胞之間的“組織關(guān)系”從而可以反映出單個細(xì)胞的生物形態(tài)作用細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法原代細(xì)胞培養(yǎng)的方法｛（1）外植塊細(xì)胞培養(yǎng)（2）單層細(xì)胞培養(yǎng)（3）懸浮細(xì)胞培養(yǎng)(1)外植塊培養(yǎng)：外植塊在一定限度內(nèi)可保持其原有組織結(jié)構(gòu)，有利于其適應(yīng)體外培養(yǎng)環(huán)境。短期培養(yǎng)的外植塊成為細(xì)胞培養(yǎng)的材料來源之一。在動物培養(yǎng)中，一經(jīng)貼壁就迅速鋪展并開始有絲分裂，逐漸形成致密的細(xì)胞單層。優(yōu)點：①更換新鮮培養(yǎng)液比較容易。一般1-3天換液一次，細(xì)胞長成單層后進(jìn)行傳代②可用于觀察某些因子對細(xì)胞生長的影響

③容易表達(dá)某些產(chǎn)物(2)單層細(xì)胞培養(yǎng)：（2-3天）(3)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)：（1）使細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)在培養(yǎng)液中連續(xù)生長（小鼠白血病細(xì)胞和腹水腫瘤細(xì)胞）（2）通過機械攪拌使細(xì)胞保持懸浮狀態(tài)，選擇得到懸浮生長的細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。機械攪拌式生物反應(yīng)器：它通常由罐體、管路、閥門、泵及馬達(dá)組成，由馬達(dá)帶動槳葉混合培養(yǎng)液，通過攪拌器的作用使細(xì)胞和養(yǎng)分在培養(yǎng)液中均勻分布。原代培養(yǎng)的細(xì)胞特點也稱初代培養(yǎng),是從供體取得組織細(xì)胞后在體外進(jìn)行的首次培養(yǎng)。細(xì)胞保持原有的性質(zhì)（二倍體細(xì)胞系）：適合作藥物測試，細(xì)胞分化研究。原代培養(yǎng)細(xì)胞部分生物學(xué)特征尚不穩(wěn)定，供體和細(xì)胞間有很大差異。二、細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

培養(yǎng)的細(xì)胞由于細(xì)胞增殖,數(shù)量增加,細(xì)胞難以繼續(xù)生長繁殖，需要進(jìn)行分瓶培養(yǎng)，將培養(yǎng)的細(xì)胞分散，以1:2或l:3以上的比率轉(zhuǎn)移到另外的容器中進(jìn)行培養(yǎng)，即為傳代培養(yǎng)，也叫做繼代培養(yǎng)。

細(xì)胞株：從原代培養(yǎng)細(xì)胞群中篩選出的具有特定性質(zhì)或標(biāo)志的細(xì)胞群，能夠繁殖50代左右，在培養(yǎng)過程中其特征始終保持（10-50代）特點：遺傳物質(zhì)不改變細(xì)胞系：從腫瘤組織培養(yǎng)建立的細(xì)胞群或培養(yǎng)過程中發(fā)生突變或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，在培養(yǎng)條件下可無限繁殖

（50代以上）。特點:遺傳物質(zhì)改變，具有癌細(xì)胞的特性，可以無限分裂有關(guān)概念一代周期內(nèi)細(xì)胞生長有三個時期所謂細(xì)胞“一代”，即從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)的一段時間。如某一細(xì)胞系為50代即該細(xì)胞已傳代50次。潛伏期指數(shù)生長期停滯期1、潛伏期2、指數(shù)生長期3、停滯期1）懸浮細(xì)胞生長傳代2）半懸浮細(xì)胞生長傳代3）貼壁細(xì)胞生長傳代傳代細(xì)胞培養(yǎng)的方法｛1.懸浮生長細(xì)胞傳代離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。直接傳代法：懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時，將上清培養(yǎng)液去除1/2一2/3，然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代。2.半懸浮生長細(xì)胞傳代此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來，進(jìn)行傳代。細(xì)胞傳代培養(yǎng)的方法貼壁生長細(xì)胞傳代方法：采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液1.吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液;2.加入1-2ml0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆蓋整個瓶底為準(zhǔn)）靜置2-10min（顯微鏡下動態(tài)監(jiān)測）;3.吸去胰蛋白酶液，加入培養(yǎng)液;4.用吸管吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液;5.加適量新鮮培養(yǎng)液于接種了細(xì)胞懸液的新培養(yǎng)瓶內(nèi);6.將后者放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。貼壁細(xì)胞的生長規(guī)律貼壁過程注意事項1．傳代培養(yǎng)時要注意無菌操作并防止細(xì)胞之間的交叉污染。所有操作要盡量靠近酒精燈火焰。每次最好只進(jìn)行一種細(xì)胞的操作。每一種細(xì)胞使用一套器材。培養(yǎng)用液應(yīng)嚴(yán)格分開。2．傳代時間的掌握：每天觀察細(xì)胞形態(tài)，掌握好細(xì)胞是否健康的標(biāo)準(zhǔn)：健康細(xì)胞的形態(tài)飽滿，折光性好，生長致密時即可傳代。3、消化時間的掌握合適過頭剛加入細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇背景知識

細(xì)胞凍存是細(xì)胞保存的主要方法