犬精液冷凍研究進展

作為一種重要的行業(yè)，該狗在規(guī)模、公共安全、肉動物化學和醫(yī)學研究方面具有較高的知名度。犬精液冷凍保存技術在犬種資源的保護、品種選育和加快良種進程等方面都能發(fā)揮關鍵作用。早在1780年,意大利生理學家Spallanzani首次用犬進行了人工授精(ArtificialInsemination,AI)試驗。Harrop又首次對犬的凍精AI進行了試驗并獲得成功。之后,人們相繼建立了有關精液冷凍、品質(zhì)鑒定以及AI的一系列優(yōu)化參數(shù)。目前在世界上一些發(fā)達國家,犬的冷凍精液與AI研究已經(jīng)得到廣泛開展,并運用于實際生產(chǎn)中,最高受胎率達90%。美國養(yǎng)犬俱樂部早在20世紀70年代即投入了大量的資金用于犬的冷凍精液和AI研究,并詳細制定了冷凍精液生產(chǎn)以及AI各主要環(huán)節(jié)的操作規(guī)程;同時規(guī)定從1981年起,只有經(jīng)過審驗合格的配種站才有資格提供犬的冷凍精液。在國內(nèi),禹學禮等對豫西土狗的冷凍精液和AI試驗獲得成功,受胎率最高可以達到57.1%,平均窩產(chǎn)仔3只。但由于我國養(yǎng)犬業(yè)起步較晚,犬冷凍精液與AI的研究尚處于試驗階段。1局部采精方法犬精液的采集是冷凍精液和人工授精的首要環(huán)節(jié)。目前比較通用的采集的方法主要有按摩采精、電刺激采精和藥物刺激采精。按摩采精法是國內(nèi)外普遍采用的一種方法,其最大的優(yōu)點是簡單易行,并且易將射精的三階段分開。按摩與假陰道相結合的采精方法也經(jīng)常被采用,但此方法的缺點是假陰道的橡膠材料容易對精子的活性質(zhì)量產(chǎn)生影響。Ohl等比較了電刺激法和按摩采精法獲得的比格獵犬精子的活率,結果表明2種方法得到的精子的活率分別為30.1%、26.3%,無顯著性差異(P>0.05)。Goodrowe等用電刺激采集紅狼的精子,獲得了71.2%的活率。Juniewicz等研究表明,對公犬靜脈注射適量的匹魯卡品比按摩采精法獲得更多量的鮮精。雖然藥物對精子質(zhì)量的影響仍有待于進一步研究,而且目前此法也很少用,但是對特殊狀態(tài)下的犬,按摩和電刺激采精法等常規(guī)方法無法采用時,藥物刺激采精是理想的選擇。2精冷凍液的使用在溫度變化過程中,精液對精子的保護能力是有限的。稀釋液不僅可以稀釋精子,給精子提供合適的滲透壓環(huán)境,而且可以為精子在平衡、冷凍過程中提供必需的能量。早期經(jīng)典的犬科動物凍精稀釋基液有多種,例如脫脂奶乳、Tris等,目前最普遍使用的一種稀釋液是添加適量果糖或者葡萄糖以及20%體積蛋黃的Tris-檸檬酸緩沖液。近年來,人們也常用經(jīng)濟、方便的椰子汁來替代傳統(tǒng)的稀釋液進行精液冷凍實驗。各種商品化的稀釋液也陸續(xù)在市場上出現(xiàn)并得到人們的認可,如德國Tiefenbach基于Tris的Triladyl,美國Pennsylvania的C.L.O.N.E.。2.1黃蛋白的應用蛋黃中的卵磷脂可以使精子質(zhì)膜在冷凍過程中損壞的磷脂得以修復,同時卵黃還是一種“滲透性緩沖劑”,使精子能耐受低滲和高滲脅迫,所以稀釋液中經(jīng)常添加蛋黃來作為精子質(zhì)膜的保護劑,其濃度隨緩沖液中其他組成成分不同而不同。但是蛋黃的應用可以引起病原體的廣泛傳播,隨著犬冷凍精子進入國際市場,人們也在尋找卵黃的替代品?？寡趸瘎┒宥追?BHT)類物質(zhì)在牛的精子冷凍中對精子質(zhì)膜具有很好的保護性,但在犬科動物中尚需進一步研究。2.2在不同的濃度及添加方法以及冷凍稀釋液中添加乙二醇理想的冷凍保護劑應該具有3方面的特征,可以快速滲入精子細胞內(nèi),對溫度依賴性低,對精子毒性小。甘油是一種高滲透性的多羥基醇,可以降低稀釋液的滲透壓,是犬精液冷凍稀釋液配方中最常用的冷凍保護劑。另一方面,甘油在一定程度上能夠降低精子的受精力,所以理想的甘油濃度不宜過高。目前犬凍精稀釋液中因為不同犬種精子特征和濃度不同,甘油的濃度從2%~10%(V/V)不等,其效果也隨稀釋液中其他成分的不同、甘油的濃度、添加方法以及冷凍解凍方式的不同而異。乙二醇(EthyleneGlycol)與甘油相比不僅有相似的化學結構,而且分子量較小,所以具有更高的滲透性。在人、小鼠等的精子冷凍試驗中乙二醇都有比甘油更好的保護效果。但在犬科動物中,其效果有很大的差異,Cavalcanti等的實驗表明,相對于甘油,在含有相同濃度乙二醇的稀釋液中,解凍后的精子活率偏低;Soares等發(fā)現(xiàn),0.25、0.50mol/L的乙二醇與0.80mol/L的甘油對精子活率的影響沒有顯著差異,但是精子在含1.0mol/L的乙二醇的稀釋液中解凍后的活率相對于前者有很大程度的降低;最近,Rota等用低滲膨脹法分別測定了5%濃度的乙二醇和甘油對精子解凍后的活力和質(zhì)膜完整性,結果顯示乙二醇可以使解凍后短期內(nèi)(1~3h)的精子具有極高的活率和很完整的質(zhì)膜,之后,無論是精子的活率和質(zhì)膜完整性都有快速降低的趨勢。在冷凍稀釋液里加入陰離子去污劑十二烷基磺酸鈉(SDS)也可以提高犬解凍精子的活率和存活時間。目前商品化的SDS類冷凍稀釋液最常用的有EquexSTMPaste、OrvusESPaste2種,并且對提高解凍后精子的活率都有很好的效果,EquexPaste也偶爾見于文獻,但普遍沒有發(fā)現(xiàn)明顯提高精液品質(zhì)的作用。Pena等推測SDS對解凍后精子的作用可能與細胞內(nèi)Ca2+濃度有關。2.3糖和葡萄糖稀釋液的濃度糖類物質(zhì)不僅可以作為保護劑保持稀釋液的滲透壓,而且可以在冷凍過程中為犬精子提供代謝所需要的能量。果糖和葡萄糖是目前最常用的2種糖,但是,文獻中這2種糖在稀釋液中的濃度從5mmol/L到120mmol/L不等。Ponglowhapan等的研究結果顯示,在卵黃-Tris稀釋液中,70mmol/L的果糖對精子的冷凍儲藏效果最好,但是相對于果糖,犬精子更傾向于消耗同濃度條件下的葡萄糖。2.4精清劑的配制Michael等研究了添加抗氧化劑對解凍后精子活率的影響,結果表明在稀釋液中分別添加維生素C(1.5mmol/L)、乙酰半胱氨酸(1.5mmol/L)、?；撬?0.6mmol/L)、過氧化氫酶(300U/mL)、維生素E(0.3mmol/L)可以不同程度的增強解凍后精子的活率,但是最佳濃度還需進一步優(yōu)化。另外,類似于牛、羊、豬的精液冷凍,磷酸二氫鉀和檸檬酸鈉等緩沖物質(zhì)用以保持精液適當?shù)膒H值;非電解質(zhì)和弱電解質(zhì)降低精清中電解質(zhì)濃度;青霉素、鏈霉素等抗菌物質(zhì)抑制細菌微生物的孳生。3不同冷凍濃度對精子活率的影響關于精子在冷凍過程中的濃度對解凍后精子質(zhì)量的影響的研究并不多,人們所使用的濃度也有很大的差距,從44×106、50×106、66×106、100×106個/mL到200×106個/mL不等,結果也沒有很顯著的差異。即便如此,目前人們大部分趨向使用等倍體積稀釋(鮮精體積∶稀釋液體積=1∶1)以及200×106個/mL濃度的精子來作為冷凍濃度。Rita等比較了以上2種濃度對解凍后精子活率的影響,雖然兩者之間無顯著性差異(P>0.05),但他認為200×106個/mL的濃度更易于量化試驗數(shù)據(jù)和簡化精子數(shù)的計算。犬精子冷凍前緩慢降溫或孵育一段時間后能增強抗凍能力。據(jù)Olar等報道,將稀釋后的精液在1h內(nèi)降至5℃,然后平衡1h,解凍后活率為44%,降溫平衡各2h,解凍后活力為45%,無顯著性差異(P>0.05),而降溫2h平衡1h,活率為34%,與前兩者差異顯著(P<0.05)。4不同種類的精子解凍研究精液冷凍的過程實質(zhì)上是精液與冷凍環(huán)境進行熱交換的過程。在冷凍過程中,精子會受到“溶液高滲效應”和冰晶兩方面的損害,所以冷凍和解凍速率是影響解凍后精子質(zhì)量的最關鍵因素。經(jīng)過探索,多年來人們建立了現(xiàn)在通用的液氮熏蒸精液冷凍法——通過調(diào)節(jié)精液與液氮液面的距離控制冷凍速率。但是,目前并沒有比較理想的冷凍速率,Dobrinski等認為,5℃/min比8℃/min、18℃/min的冷凍速率會獲得更好的解凍活率,Sreedhar等用差示掃描量熱法測定了比格獵犬精子在冷凍過程中的一系列熱參數(shù),推測最理想的冷凍速率應該是10~30℃/min之間。犬凍精的劑型有顆粒、細管和安瓿型3種,細管型又分0.25、0.5、2.5mL3種,細管型易于標記、貯存和運輸,而且冷凍快,受胎率較高,所以現(xiàn)在北美國家大都使用細管凍精。Thomas等報道,采用Tris冷凍稀釋液的0.5mL細管精子解凍后活率近似于顆粒型而優(yōu)于0.25mL細管型。但從生產(chǎn)角度來看,由于犬的每次輸精量較大,約1.0~1.5mL,所以安瓿型最佳。解凍過程與冷凍過程一樣,必須通過精子冰晶化的危險溫度區(qū),才不致于對精子細胞造成損傷,過快或者過慢的速率都會導致精子死亡,實踐中以30~40℃的水溫解凍較為實用。一般地認為,理想的解凍速率與冷凍速率密切相關,快速冷凍的精子需要相應較快的解凍速率,慢速冷凍的精子需要較慢的解凍速率,但是因劑型不同解凍方法也不盡相同。對于0.5mL細管,70℃水浴6.5s,30℃水浴30s,37℃水浴2min、55℃水浴5s都有報道。顆粒型凍精的解凍可直接將1~2粒凍精放入經(jīng)干燥滅菌的試管內(nèi),在50~55℃水浴中不斷搖晃,至融化1/2~3/4后取出。安瓿型凍精的解凍是將安瓿在50~55℃水浴中不斷搖晃,至凍精全部融化后取出。5精子質(zhì)膜的檢測傳統(tǒng)的犬精液品質(zhì)評定主要是測定精子存活率和精子密度2個指標,隨著對凍精研究的發(fā)展,目前精子活率、質(zhì)膜完整性和頂體狀態(tài)是普遍的解凍后精子檢測指標。精子活性的評估最簡單的方法是顯微鏡肉眼觀察法,方便、經(jīng)濟、快速,但是受主觀因素的影響較大。計算機輔助精液分析系統(tǒng)的出現(xiàn)對解凍后游動精子的比例和活性程度提供了客觀可靠的數(shù)據(jù)信息。質(zhì)膜完整性的檢測方法主要有以下2種。在低滲溶液中,如果精子尾部發(fā)生膨脹彎曲,說明精子質(zhì)膜功能完整。因此低滲膨脹法經(jīng)常用來檢測精子質(zhì)膜的完整性。解凍后的精子因為大量稀釋液及冷凍保護劑的存在,質(zhì)膜完整性的檢測不可以采用常規(guī)染色的方法,熒光標記法可以不受稀釋液的影響,廣泛的被用來檢測解凍后精子質(zhì)膜的完整狀態(tài)。常用的熒光染料主要有2類:對死精子特異的Hoechst33258、溴化乙錠、溴乙啡錠二聚體和Yo-Pro-1,它們不能夠穿透質(zhì)膜,染料只能進入質(zhì)膜破損的精子與DNA結合;對活精子特異的有SYBR-14、羧基熒光素雙醋酸鹽、羧基二甲基熒光素雙醋酸鹽、Carboxy-SNARF-1和SYTO-17等,它們是膜通透性的染料,能進入質(zhì)膜完整的精子。熒光染色后,可在熒光顯微鏡或者流式細胞儀檢測觀察。Pena等用Carboxy-SNARF-1、PI、FITC-PSA三重熒光標記法可同時檢測冷凍前和解凍后精子質(zhì)膜的完整性。精子在獲能和頂體反應過程中,精子膜外源凝集素受體會發(fā)生變化,可以利用異硫氰酸熒光素(FITC)標記的凝集素檢測精子的頂體狀態(tài)。已經(jīng)有多種凝集素被用于精子頂體狀態(tài)檢測,如花生凝集素(PNA)、豌豆凝集素(PSA)、刀豆凝集素(ConA)和植物血凝素(RCA)等。對犬科動物來說,PSA和PNA對獲能條件下的精子具有顯著的副影響。Ca2+內(nèi)流也是精子獲能的一種表現(xiàn)形式,熒光抗生素金霉素(CTC)可以結合細胞內(nèi)的Ca2+形成CTC-Ca2+復合體而增強熒光度,用來檢測精子獲能和頂體狀態(tài)。而犬精子體外受精能力的常用分析法為透明帶結合法。6凍精、輸精犬科動物為季節(jié)性單次發(fā)情,但由于馴化時間較長,現(xiàn)在家犬每年發(fā)情2次,而許多野生半馴化的犬科動物,如狐貍和狼仍為季節(jié)性單次發(fā)情。通常母犬在LH峰后24~78h發(fā)生排卵,排出的初級卵母細胞還需2~3d才達到成熟,故用凍精進行人工授精應在LH達到峰值后3~7d、即犬排卵后2~5d進行,此時檢測孕酮濃度應為30~75mol/L,且角質(zhì)化細胞數(shù)應超過60%。犬的輸精法主要有外科手術法、陰道內(nèi)輸精法和子宮內(nèi)輸精法3種。外科手術法操作比較繁瑣,不宜應用推廣;陰道內(nèi)輸精法雖然簡單易行,但妊娠率低;而采用非手術子宮內(nèi)輸精法(又包括內(nèi)窺鏡、通過子宮頸插入導管、腹外把握子宮頸的子宮內(nèi)輸精3種)效果很好,其出生率和產(chǎn)仔數(shù)與自然交配的