生物分子傳感器ap合成酶的研究進(jìn)展

1生物分子馬達(dá)的分類生物分子達(dá)是將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為力學(xué)能的生物分子。它們廣泛存在于細(xì)胞中，通常位于納米規(guī)模內(nèi)，因此也被稱為納米機器。生物分子馬達(dá)能主動從環(huán)境中俘獲“能量分子”ATP(adenosinetriphosphate,三磷酸腺苷),借助熱漲落來消耗ATP水解所釋放出的化學(xué)能,進(jìn)而改變自己的構(gòu)象。一旦與軌道結(jié)合,馬達(dá)通過構(gòu)象變換產(chǎn)生與軌道間的相對運動,因此,它們具備“自動性”(motility)。生物分子馬達(dá)按運動形式可分為線動和轉(zhuǎn)動兩大類。線動馬達(dá)常常與特定軌道結(jié)合在一起,利用ATP水解所釋放出的化學(xué)能產(chǎn)生與軌道的相對運動,其作用機制與人造發(fā)動機類似。這類馬達(dá)主要有肌球蛋白(myosin)、驅(qū)動蛋白(kinesin)和動力蛋白(dynein)等;轉(zhuǎn)動馬達(dá)則類似于人造電機,也由“轉(zhuǎn)子”和“定子”兩部分組成,這類馬達(dá)包括鞭毛馬達(dá)(flagellar)和ATP合成酶(ATPsynthase)等,它們往往是可逆的。ATP合成酶廣泛存在于細(xì)菌、葉綠體和線粒體膜上。它由兩個轉(zhuǎn)動馬達(dá)Fo和F1共軸(cn-ε-γ)耦合而成(圖1,見封二)。嵌膜部分(疏水)Fo由質(zhì)子通道(cn)和蛋白a組成;而突出部分(親水)F1的結(jié)構(gòu)類似于“電機”,其“定子”由三對αβ蛋白環(huán)成,γ蛋白則是其“轉(zhuǎn)子”。ATP在F1中的水解是釋能反應(yīng),它驅(qū)動γ軸逆時針轉(zhuǎn)動(自上往下觀察);反之,如果外力拖動“轉(zhuǎn)子”順時針轉(zhuǎn)動,則F1合成ATP。因此F1既是“電動機”又是“發(fā)電機”。F1的“定子”通過蛋白組合δb2與Fo的a蛋白緊緊結(jié)合在一起。Fo中跨膜質(zhì)子梯度導(dǎo)致的質(zhì)子流驅(qū)動離子通道cn相對于蛋白a順時針轉(zhuǎn)動;F1中ATP的自發(fā)水解驅(qū)動“轉(zhuǎn)子”逆時針轉(zhuǎn)動,這兩種反向“自動”又是共軸耦合的,因此,馬達(dá)是合成酶(發(fā)電機)還是水解酶(電動機)完全取決于生化環(huán)境。2為什么要研究異質(zhì)酶？2.1atp合成酶系統(tǒng)ATP是有機組織的“能量貨幣”。它由腺苷連接三個磷酸基團(tuán)組成(圖2,見封二)。如果最外的磷酸基團(tuán)(Pi)斷裂,剩余的便是ADP,同時釋放的磷酸鍵能(約20kBT)與細(xì)胞內(nèi)各種有序運動每個循環(huán)所需能量相當(dāng)。ATP合成酶的主要功能是將營養(yǎng)因子燃燒所釋放出的低能的共價鍵能量集結(jié)到高能的ATP磷酸鍵上,使ATP、ADP和Pi三分子循環(huán)參與所有生命過程。因此ATP的合成機制是人類在揭示生命過程中首先面臨的生物能學(xué)(bioenergetics)問題。2.2基于atp合成酶的機器轉(zhuǎn)換系統(tǒng)給藥人造機器要實現(xiàn)化學(xué)能與力學(xué)能的轉(zhuǎn)化必須借助中間介質(zhì),如熱或電,即能量轉(zhuǎn)化是間接的,這就決定了人造機器的能量轉(zhuǎn)化效率是不理想的。ATP合成酶則不同,它將化學(xué)反應(yīng)所釋放的化學(xué)鍵能通過自身的構(gòu)象變化直接轉(zhuǎn)換成力學(xué)能,其轉(zhuǎn)換效率接近100%。因此,在機器的能量轉(zhuǎn)化效率方面,ATP合成酶這個現(xiàn)成的力學(xué)化學(xué)耦合(mechanochemicalcoupling)系統(tǒng)給我們帶來很多啟示。這也是為什么分子馬達(dá)的力學(xué)化學(xué)耦合機制令科學(xué)家著迷的原因。2.3adp/pi的含義傳統(tǒng)的酶動力學(xué)只考慮單個底物的不可逆反應(yīng),而ATP合成酶是由兩個轉(zhuǎn)動馬達(dá)耦合而成的可逆酶。當(dāng)它處在合成酶時,ADP和Pi是底物,ATP是產(chǎn)物;反之,如果工作在水解狀態(tài),則ATP是底物,而ADP和Pi是產(chǎn)物。因此,它們既是底物又是產(chǎn)物且結(jié)合在同一個位點,其角色互換又與跨膜質(zhì)子驅(qū)動勢(proton-motiveforce)的大小有關(guān)。這種復(fù)雜的酶動力學(xué)過程是生物體內(nèi)普遍存在的,也是我們研究生命科學(xué)所必須克服的難題之一。2.4boltzhen模型在傳統(tǒng)統(tǒng)計中,一旦我們知道系統(tǒng)的始態(tài)和終態(tài)能量及連接兩態(tài)的路徑,便可確定系統(tǒng)對外作的功。事實上,兩態(tài)的能量及系統(tǒng)與環(huán)境在路徑上的交換熱在Boltzmann統(tǒng)計上均有kBT漲落,只是在宏觀統(tǒng)計中,這個量級的漲落被忽略了。如果系統(tǒng)很小,這樣的漲落則不能被忽略。這類微觀系統(tǒng)的統(tǒng)計熱力學(xué)問題是納米科學(xué)當(dāng)前所面臨的研究障礙。ATP合成酶正是這樣的微觀系統(tǒng),它為物理學(xué)家解決該問題提供了一個理想的研究平臺。3關(guān)于pd-反應(yīng)的重要進(jìn)展3.1能量貨幣atp能量分子ATP是由德國科學(xué)家KarlLohmann于1929年在肌肉組織中發(fā)現(xiàn)的,但它在生命過程中所扮演的角色直到1939～1941年才被逐漸了解;德裔美國科學(xué)家FritzAlbertLipmann闡明了ATP是細(xì)胞的“能量貨幣”,其化學(xué)能儲藏于高能磷酸鍵中;1948年,英國科學(xué)家AlexanderRobertusTodd首次人工合成了ATP;20世紀(jì)40～50年代,科學(xué)家觀察到在細(xì)胞呼吸或光合作用期間,線粒體或葉綠體內(nèi)的ATP濃度明顯上升;1960年美國科學(xué)家EfraimRacker成功地從線粒體膜上分離出ATP合成酶的突出部分,由于它是首次被定義的與細(xì)胞呼吸耦聯(lián)的因子,因此被命名為F1(factor1);1965年,他和Kagawa又解析出嵌膜部分,并定名為Fo(factorofoligomycin),從此,該馬達(dá)被稱為FoF1ATP合成酶;1957年,丹麥科學(xué)家JensC.Skou發(fā)現(xiàn)了在活體細(xì)胞內(nèi)維持鈉、鉀離子平衡起主要作用的離子泵,該泵結(jié)構(gòu)與ATP合成酶類似。3.2跨膜質(zhì)譜合成衍生物基于有關(guān)ATP合成及細(xì)胞呼吸之間的關(guān)聯(lián)研究,英國科學(xué)家PeterDennisMitchell于1961年提出了“化學(xué)滲透假說”(chemiosmotichypothesis),認(rèn)為是跨膜質(zhì)子驅(qū)動勢推動了ATP的合成;1973年,美國科學(xué)家PaulD.Boyer等建立了三個β位點的順序構(gòu)象變換與ATP合成的關(guān)系,即“結(jié)合變換機制”(bindingchangemechanism)(圖3A、B、C、D),并推測了γ軸的非軸對稱性;1994年,英國科學(xué)家JohnE.Walker通過晶體結(jié)構(gòu)(圖3a、b、c、d)證實了γ軸結(jié)構(gòu)上的非軸對稱性,與Boyer分享1997年Nobel獎。3.3tf的“自動性”與熒光單分子檢測1990年代以前,對細(xì)胞內(nèi)生物大分子的化學(xué)性質(zhì)的研究均通過系綜測量進(jìn)行,其結(jié)果反映的是大量分子的平均行為,而人類對其物理性質(zhì)的認(rèn)識僅停留在測序分類和晶體結(jié)構(gòu)之類的靜態(tài)層面上。我們對于生物分子馬達(dá)的興趣點是它們的“自動性”,即它們是如何啟動、運動和發(fā)力、以何種方式沿軌道運動、每個運動周期消耗多少燃料、效率如何等,要回答這些問題必須借助20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的單分子操縱(manipulation)和實時視見(visualizing)技術(shù),例如原子力顯微鏡(AFM)、光鑷(opticaltweezers)、流場拖曳(hydrodynamicdrag)、磁鉗(magnetictweezers)、玻纖微管(glassmicropiptte)、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)、及熒光單分子檢測(fluorescencesingle-moleculedetection)等。這些技術(shù)既可探測0.1～100nm的位移,又可對單個馬達(dá)施加0.1～104pN的外力。在F1“自動性”(ATP水解)的單分子研究方面,突破性進(jìn)展大部分是由日本早稻田大學(xué)的Kinosita小組作出的。1997年,他們實時視見了F1在ATP溶液中自發(fā)轉(zhuǎn)動(圖4,見封二)(這種“自動”在1998和1999年也相繼被德國Junge和日本Futai小組借助不同的方法觀察到);1998年,他們又發(fā)現(xiàn)這種轉(zhuǎn)動是“步進(jìn)”的,每步轉(zhuǎn)過120°;2001—2004年,他們進(jìn)一步觀測到120°的步進(jìn)包含著80°和40°兩個分步,同時證實是第三個位點的核苷結(jié)合推動了γ軸的轉(zhuǎn)動;2007年,他們用磁鑷結(jié)合全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)(TIRF,圖5,見封二)確認(rèn)了磷酸根的釋放是個力學(xué)過程(圖6),這一過程伴隨著40°分步。該實驗同時證實了帶熒光分子的核苷從結(jié)合到釋放需要經(jīng)歷240°轉(zhuǎn)動,即兩步(圖7)。在F1的“被動”實驗方面,2004年,他們和德國Graber小組分別用磁鉗和質(zhì)子梯度鉗(ΔpHclamp)在體外實現(xiàn)了ATP的合成。在Fo的動態(tài)研究方面,2005年,我國樂加昌小組測量了質(zhì)子驅(qū)動勢作用下Fo產(chǎn)生的扭矩。這些單分子實驗給出了生物分子實時的行為與性質(zhì)。3.4膜質(zhì)熱學(xué)酶學(xué)研究上述研究主要集中在分離的F1部分,利用的是其水解的“自動性”。而作為一個完整的全酶,其工作機制還涉及到跨膜質(zhì)子驅(qū)動勢。1990年以來,Graber、Rumberg和Strotmann小組先后測量了從菠菜葉綠體中分離出來的ATP合成酶(CFoF1)的全酶動力學(xué),發(fā)現(xiàn)ADP和Pi的米氏常數(shù)同時隨跨膜質(zhì)子梯度的上升而下降。他們先將CFoF1重組到磷脂膜上(圖8),并使用一種精巧的質(zhì)子梯度鉗技術(shù)。2007年,舒咬根等提出了力學(xué)化學(xué)緊耦合模型,并解析了該馬達(dá)的酶動力學(xué)。根據(jù)上述實驗結(jié)果,該模型排除了ADP和Pi有序結(jié)合的可能性,獲得了該可逆馬達(dá)的“相圖”(圖9,見封二)。3.5cfof1的整理在馬達(dá)的整體結(jié)構(gòu)圖像方面,2000年,Graber小組用電境測得了CFoF1的全貌(圖10,見封二)。在質(zhì)子通道數(shù)的測定方面,1999和2000年,Walker小組和德國Muller小組分別測得EFo(大腸桿菌)和CFo的質(zhì)子通道數(shù)依次為10和14(圖11,見封二)。4納米生物機器系統(tǒng)的應(yīng)用意義21世紀(jì)是納米科技的世紀(jì)。高集成、智能化納米器件的開發(fā)必將推動信息技術(shù)、生物技術(shù)、新材料技術(shù)、能源技術(shù)及環(huán)境技術(shù)等的高速發(fā)展。納米技術(shù)是目前國際科技競爭的前沿,也是對未來社會發(fā)展、經(jīng)濟振興、國力增強最有影響力的戰(zhàn)略研究領(lǐng)域。人工納米機器的構(gòu)建與應(yīng)用是此前沿領(lǐng)域國際上最具有挑戰(zhàn)性的熱點課題之一。21世紀(jì)也是生命科學(xué)的世紀(jì)。生命活動是自然界最精巧的運動方式,它賴以存在的基礎(chǔ)是生物大分子能夠響應(yīng)外界刺激(包括環(huán)境及外場條件的改變)。近20年來,分子生物學(xué)和單分子生物物理學(xué)所取得的突破性進(jìn)展揭示了生物分子馬達(dá)在生命過程中扮演著核心角色。這些過程包括ATP合成,基因轉(zhuǎn)錄、翻譯,物質(zhì)輸運,細(xì)胞運動與分裂等。因此,科學(xué)界已全面確立了將蛋白酶理解為生物單分子機器的觀點。生物分子馬達(dá)的發(fā)現(xiàn)一方面使人們對生命的復(fù)雜有序有了新的認(rèn)識,另一方面也啟示和激發(fā)科學(xué)家去建造能與自然相媲美的納米機器。生物分子機器是上億年進(jìn)化的產(chǎn)物,尺寸大多在幾個納米到幾百個納米之間,其結(jié)構(gòu)、動態(tài)與功能的關(guān)系為人工納米機器的設(shè)計和制備提供了絕佳的范例和素材。人們可以直接利用天然蛋白質(zhì)酶為材料構(gòu)建能夠?qū)崿F(xiàn)能量轉(zhuǎn)換的分子機器以滿足實際需求。通過研究各種納米生物機器物理化學(xué)過程,尤其是納米尺度的物理、化學(xué)作用的特殊性(如熱漲落的重要性等),人們可以探索納米生物機器的普遍運動規(guī)律,并有可能衍生新的物理概念。這些新概念可指導(dǎo)人們找出優(yōu)化設(shè)計原則,進(jìn)而引導(dǎo)人工納米機器的構(gòu)建與應(yīng)用,其作用不亞于卡諾熱機模型對工業(yè)革命的影響。對納米生物機器系統(tǒng)的研究不僅對我們了解生命的奧秘、構(gòu)建人工納米機器及機器人系統(tǒng)有著重要意義,還將為智能材料體系的設(shè)計、構(gòu)造,生物傳感器以及傳統(tǒng)生物芯片產(chǎn)業(yè)的改造和升級換代提供理論和技術(shù)基礎(chǔ)。開展納米生物機器運動機理與應(yīng)用研究有利于保持我國在此領(lǐng)域的國際競爭力和搶占國際納米技術(shù)發(fā)展的制高點,對發(fā)展具有自主知識產(chǎn)權(quán)、對國民健康及國防建設(shè)具有重要應(yīng)用價值的納米生物技術(shù)也將起到關(guān)鍵性作用。ATP合成酶是自然界最精妙的納米機器之一,有關(guān)它的研究已經(jīng)產(chǎn)生了六位Nobel獎得主,其重要性不言而喻。發(fā)達(dá)國家對該馬達(dá)的研究是系統(tǒng)的:Boyer、Cross和Senior等小組的研究側(cè)重于生化方面;Walker小組壟斷了F1各部件的晶體結(jié)構(gòu);而Kinosita小組又幾乎主宰了F1單分子行為的檢測[24,27,28,29,30,31];在全酶動力學(xué)測量方面,Graber、Rumberg和Strotmann三小組無疑已走在世界前列,他們能在磷脂膜上重組該馬達(dá)并發(fā)展出一種精巧的質(zhì)子梯度鉗技術(shù)。盡管如此,人類對ATP合成機制的了解還非常膚淺,其中對F1的理解還停留在唯象層面,對Fo的認(rèn)識則仍處在卡通階段。我們面臨的主要問題如下:(1)如何獲得Fo的精細(xì)結(jié)構(gòu)圖像;(2)質(zhì)子通道c環(huán)與蛋白a之間的相互作用機制;(3)質(zhì)子流向與馬達(dá)轉(zhuǎn)向的對應(yīng)切換機制;(4)“轉(zhuǎn)子”γ軸的儲