中華卵索線蟲ra-1基因克隆及表達分析

太陽蟲是昆蟲的一種古老昆蟲，可以廣泛應用于蔬菜、農(nóng)林、衛(wèi)生害蟲的預防和控制。該類線蟲的性別分化較為特殊,寄生期的營養(yǎng)競爭壓力決定其雌、雄性別分化,即每一昆蟲體內(nèi)寄生的線蟲越多,每條線蟲吸收的營養(yǎng)越少,越有可能發(fā)育為雄蟲,相反則發(fā)育為雌蟲。目前,人們對遺傳決定型(GSD)的秀麗隱桿線蟲Caenorhabditiselegans、環(huán)境(溫度)決定型(ESD)的爬行動物等性別決定與分化機制的研究較多,但尚未見有關營養(yǎng)決定這一特殊性別分化機制的報道。然而動物的性別決定機制,無論是遺傳決定型還是環(huán)境決定型,最終都是通過體內(nèi)性別分化基因的表達與調(diào)控實現(xiàn)的。tra-1基因位于秀麗隱桿線蟲C.elegans性別分化信號級聯(lián)通路的上游終端,通過mRNA差異剪接產(chǎn)生兩種mRNA:(1)5kb的轉錄產(chǎn)物,編碼由1110個氨基酸組成,具有5個C2H2型鋅指結構的蛋白質(zhì)TRA-1A;(2)1.5kb的轉錄產(chǎn)物,編碼由288個氨基酸組成,只具有TRA-1A中第1～2鋅指的蛋白質(zhì)TRA-1B。前者屬GLI轉錄因子家族,具有完全的雌性化效應;后者沒有明顯功能。此外,在C.elegans體細胞中,TRA-1A還具有CI和GLI的一些功能,如調(diào)控細胞增殖和胚胎的早期發(fā)育等。目前,已從自由生活線蟲C.briggsae及Pristionchuspacificus中克隆得到tra-1基因,并證實了其結構及功能的保守性。本研究以中華卵索線蟲Ovomermissinensis為材料,通過克隆具有很大保守性的性別分化相關基因tra-1,分析其序列特點及表達模式,并結合該線蟲的形態(tài)學研究結果,探討線蟲營養(yǎng)決定型與遺傳決定型性別分化機制在分子水平上的異同性。1材料和方法1.1宿主棉鈴蟲及實時熒光定量pcr中華卵索線蟲懷卵雌蟲于2001年3月采自河南省上蔡縣小麥農(nóng)田,室溫26±1℃條件下產(chǎn)卵、孵化出感染期幼蟲(II期幼蟲或寄生前期幼蟲)后,在本實驗室通過宿主棉鈴蟲體內(nèi)培養(yǎng)進行傳代。收集胚胎發(fā)育期卵、感染期幼蟲、寄生期幼蟲(1～6天)、寄生后期雌雄幼蟲、雌雄成蟲及懷卵雌蟲,液氮速凍,-70℃保存?zhèn)溆谩Ｋ拗髅掴徬x由中國科學院武漢病毒研究所提供,室內(nèi)26±1℃條件下人工飼養(yǎng)至所需蟲齡。總RNA提取試劑TrizolReagent,Invitrogen公司;ExTaqTM、SYBRPremixExTaqTM及MLV反轉錄酶,大連TaKaRa公司;膠回收試劑盒,上海生工生物技術服務有限公司;pTA-2載體連接試劑盒,武漢飛羿科技有限公司;RQ1RNase-FreeDNase,Promega公司;RACE試劑盒,Clontech公司;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。實時熒光定量PCR儀,Bio-Rad公司。大腸桿菌DH5α,由本實驗室保存。所有引物合成及DNA測序,由Invitrogen公司完成。1.2總rna的提取研缽加液氮數(shù)次至足夠冷,加入樣品,研磨至粉末。每100mg組織中加1mLTrizol試劑,提取總RNA。電泳檢測總RNA完整性,紫外分光光度計檢測其純度和濃度。1.3遺傳因素1的克隆和序列分析1.3.1重組質(zhì)粒的鑒定以各發(fā)育期線蟲提取的總RNA為模板,以MLV反轉錄酶進行反轉錄,合成cDNA第一鏈。以制備的cDNA為模板,通過巢式PCR擴增tra-1基因編碼區(qū)保守序列(簡并引物:AP1,5′-CCNTTYAARGCNYWNTAKATGYT-3′;AP2,5′-ARNGWNGWNGGRTCNGTRTA-3′;AP3,5′-CARTAYATGYTNGTNGTNCA-3′;AP4,5′-TGNGTNCKRTTYTGRTGYTTNGC-3′)。目的片段大小約為200bp,電泳、純化后,按照pTA-2載體連接試劑盒說明書,將純化的目的片段與pTA-2載體連接,重組質(zhì)粒轉化入DH5α感受態(tài)細菌,通過藍白斑篩選,隨機挑取3個陽性克隆進行測序分析。根據(jù)測序結果預測氨基酸序列,并進行同源性分析,鑒定tra-1基因cDNA片段。1.3.2基于4.4回復突變株的構建根據(jù)已獲得tra-1基因的部分片段設計基因特異性引物GSP121:5′-TACGCTTGCGAGTTTCCCGGTTGTTC-3′,根據(jù)SMARTTMRACEcDNA擴增試劑盒產(chǎn)品說明書進行3′cDNA末端快速擴增,回收目的片段,克隆并測序。1.3.3進行序列拼接用DNAStar軟件包中的EditSeq軟件進行序列拼接。通過cDNA序列推測其氨基酸序列,用BLAST軟件在NCBI上進行同源性分析,多序列比對采用ClustalW軟件。1.4tra-1和18srrna基因重組質(zhì)粒的構建采用RQ1RNase-FreeDNase處理總RNA,去除基因組DNA污染。使用隨機引物Radome9mers和逆轉錄酶進行逆轉錄反應,制備cDNA第一鏈。以雌成蟲cDNA第一鏈為模板,用tra-1和18SrRNA基因特異性引物分別進行PCR擴增,預期片段大小分別為96bp和106bp。特異性引物名稱及序列為:Tra-U:5′-CTGAAAACTCATCTTCGATCTC-3′;Tra-D:5′-GAGTGCGTCCTGTTTTGATGTT-3′;18S-U:5′-GCCTGCGGCTTAATTTGACTC-3′;18S-D:5′-ACCAACTAAGAACGGCCATGC-3′。將目的片段切膠回收、連接、轉化。將測序檢測到的陽性克隆進行擴大培養(yǎng),用堿裂解法提取tra-1和18SrRNA基因的重組質(zhì)粒。將提取的質(zhì)粒DNA分別稀釋1、10、100、1000和10000倍后(至少5個稀釋梯度,每梯度設3次重復)做模板,在實時熒光定量PCR儀上進行擴增,用于生成標準曲線。PCR反應體系為20μL,其中SYBRPremixTaq酶10μL,模板2μL,上、下游引物各0.4μL,ROXReferenceDye(50×)0.4μL,ddH2O6.8μL。程序設置如下:95℃2min;95℃10s,58℃20s,72℃20s,82℃1s,40個循環(huán);最后溶解曲線從55℃到98℃每0.2℃讀1s,同時進行ROX值校正。分別制作tra-1基因和18SrRNA基因標準曲線,并由此讀取樣品tra-1基因和18SrRNA基因的拷貝數(shù),用tra-1基因的拷貝數(shù)除以18SrRNA基因的拷貝數(shù)即得到該樣品tra-1基因的相對表達量。每樣品設3次重復。試驗數(shù)據(jù)以Xˉˉˉ±SEXˉ±SE表示,運用SPSS數(shù)據(jù)處理軟件進行方差分析,并用Duncan氏新復極差法進行多重比較(P<0.05)。1.5實時熒光定量pcr檢測分別以胚胎發(fā)育期卵、感染期幼蟲、寄生1～6天幼蟲、寄生后期雌雄幼蟲、雌雄成蟲以及懷卵雌蟲(此試驗組線蟲與宿主之間的感染比例為20∶1)總RNA為樣品,進行實時熒光定量PCR。1.6感染強度對中國岡托布沿線物種的發(fā)現(xiàn)影響以感染強度不同的兩組(線蟲/宿主:A組為40/1,B組為10/1)、寄生1～6天后幼線蟲總RNA為樣品,進行實時熒光定量PCR。2結果與分析2.1調(diào)tra-2氨基酸序列及序列分析通過RT-PCR和3′-RACE,獲得中華卵索線蟲tra-1基因cDNA序列部分片段,長度為800bp,含終止密碼子TAA,據(jù)此推導出該基因對應蛋白質(zhì)C端的195個氨基酸殘基。用SMART軟件對其蛋白質(zhì)二級結構進行預測,結果顯示該多肽含有3個連續(xù)的C2H2型鋅指,每個鋅指包含29～30個氨基酸,其在推導的氨基酸殘基序列上的定位如圖1所示。與tra-1同源基因cDNA的全長序列相比,此次獲得的中華卵索線蟲cDNA序列包含第3～5鋅指完整序列及第2鋅指部分序列。利用ClustalW程序將推導的氨基酸序列與GenBank中人GLI3、果蠅CiD、C.elegansTRA-1A、C.briggaseTRA-1A和P.pacificusTRA-1A氨基酸序列進行多序列聯(lián)配。結果表明,它們在鋅指結構區(qū)域具有較高的相似性,相似度分別為70%、71%、71%、73%和77%(圖2)。2.2不同發(fā)育卵期tra-1的相對表達量實時熒光定量結果顯示,tra-1基因在雌成蟲中相對表達量最高(0.0276±0.0004),與其它蟲期的差異極顯著(P<0.01);在懷卵雌蟲與胚胎發(fā)育期卵中tra-1相對表達量明顯下降(0.0129±0.0002和0.0108±0.0003),但仍顯著高于除雌成蟲外的其它各發(fā)育蟲期(P<0.05);在感染期幼蟲、寄生1～6天幼蟲、寄生后期雌、雄幼蟲中tra-1的相對表達量則無明顯差異(P>0.05)(圖3)。2.3幼線蟲之間tra-1基因轉錄水平熒光定量結果顯示,在寄生線蟲與宿主感染比例分別為A組40/1及B組10/1的兩組試驗中,寄生1～6天后幼線蟲之間tra-1基因轉錄水平為0.0041±0.0004～0.0062±0.0002,無顯著差異(P>0.05)(圖4)。3中國食卵成蟲與中華卵索線蟲的轉錄活性從昆蟲病原索科線蟲中克隆得到tra-1基因cDNA片段,由該cDNA片段推導的氨基酸序列與人GLI3、果蠅CiD結構域以及自由生活線蟲tra-1編碼的TRA-1A蛋白質(zhì)序列在鋅指區(qū)域具有較高的相似性,即它們同屬于GLI轉錄因子家族。李俊莉等觀察表明,剛從宿主體內(nèi)脫出的寄生后期幼線蟲生殖原基很小,幾乎沒有發(fā)育;蛻皮后雌、雄成蟲生殖腺已開始發(fā)育;交配后的雌蟲,其生殖腺的體積進一步增大,約占整個假體腔的1/4～1/3;懷卵雌蟲的生殖系統(tǒng)或子宮更加發(fā)達,整個假體腔幾乎充滿了卵。本研究結果顯示:tra-1基因在寄生各期幼蟲及寄生后期雌、雄幼蟲中轉錄水平較低,且相互間無顯著差異;在雌成蟲中轉錄水平極顯著高于其它各蟲期(P<0.01)。由此推測,在中華卵索線蟲中,tra-1基因的高水平表達促進雌性生殖系統(tǒng)的發(fā)育,這與自由生活線蟲C.elegans、C.briggsae和P.pacificus中的tra-1基因功能相同。此外,本研究還檢測到tra-1基因在懷卵雌蟲及胚胎中相對表達量雖顯著低于雌成蟲,但仍顯著高于其它蟲期(P<0.05),表明中華卵索線蟲體內(nèi)tra-1亦參與調(diào)控卵的形成及胚胎的發(fā)育,這與tra-1基因在C.elegans中的功能相似。高原等通過大量體內(nèi)培養(yǎng)中華卵索線蟲發(fā)現(xiàn),每條