乳鐵蛋白的分別純化乳鐵蛋白的分別純化于蕾百的乳鐵蛋白具有多種生物學(xué)功能，能提高腸道細胞對鐵離子的吸取，具有抗菌，抗病毒，抗氧化，抗癌，調(diào)整機體免疫反響等多種功能，并己廣泛應(yīng)用于食品，畜牧等行業(yè)。LF 可耐受較高溫度,使之在飼料加工過程中不易變性失活，它促進鐵的轉(zhuǎn)運和吸取，可以治療仔豬貧血。它具有廣譜的抗菌，抗病毒作用，可用來預(yù)防和治療仔豬腹瀉:它具有調(diào)整免疫系統(tǒng)活性的作用，增加家畜對疾病的抵抗力，它具有抗真菌和抗脂質(zhì)氧化作用,可用作防霉劑和抗氧化劑。乳鐵蛋白LF，是存在于哺乳動物 泌液中的一種鐵離子結(jié)合蛋白構(gòu)造與轉(zhuǎn)鐵蛋白相似，但鐵結(jié)合力氣是轉(zhuǎn)鐵蛋白的260倍，LF是由689個氨基酸組成的單一多鏈分子。每個分子中有2個金屬結(jié)合位點，每個位點可結(jié)合一個Fe34和一個HCO3

“或CO3。Lf的鐵結(jié)合力氣與鹽的種類和濃度有關(guān)，在有較高濃度碳酸鹽的場合，其鐵結(jié)合力氣增加，而在有較高濃度檸檬酸鹽的狀況下，其鐵LF如離子交換層析色譜，超濾，固定化單克隆抗體，親和層析等從人乳或牛分別純化LF,但色譜法和固定化單克隆抗體法雖能獲LF但價格昂貴技術(shù)要求高，所以并不適用于工業(yè)化生產(chǎn).超濾法簡便費用低，易形成工業(yè)化生產(chǎn)，LF純度低膜需要常常清洗。琶譜法 一■是利用固定基質(zhì)和吸附質(zhì)間物理或化學(xué)吸附強度的不同來分別物質(zhì)的。疏水性的相互作用色譜在乳鐵蛋白的分離上有重要的應(yīng)用。一有殳以ToyopearI為基質(zhì)，在〔NH/2SO4溶液中到達吸附平衡后再0.25moI/LHAc0.25moI/LNaOH洗脫，得純度為80%的乳鐵蛋白，其缺點是吸附容量比較小，效率比較低.附法1DEAE纖維素陰離子交換樹脂分別純化得到較純的Lf?2磷酸纖維素交換色譜法竣甲基陽離子交換色譜法被廣泛應(yīng)用于Lf和乳過氧化氫酶的分別純化，pH77,005mol/L的磷酸鈉溶液或濃03mol/LNaCl溶液作為洗脫液來洗脫，它可將Lfa,b兩種變異體分別出來，而且樹脂能用0.2mol/LNaOH02mol/L的HCI溶液再生，此法相對來說要更有效親合色譜法不容基質(zhì)-連接物-隔離臂-連接物-配體，基質(zhì)一般IE瓊脂多糖，隔離臂一般多是有一定長度的可以連接■基質(zhì)的有機物例如，肝素瓊脂糖親合色譜能從瓊脂一步分別來得到乳鐵蛋白，并且經(jīng)電泳分析說明其純度極高。例如，換Cu241,4一丁二醇二環(huán)氧甘油瞇亞氨二乙酸瓊脂糖，用Cu24交換后該樹脂呈藍色，1/22/3是銅樹脂下半局部未直接交換的Cu2+pH值&0-2.8濃度0 05mol/L的Tris-HAC溶液或濃度0.5mol/L的NaCI溶液作為洗脫液, 般來說,25mL的樹脂1L干酪乳清的Lf和免疫球蛋白，并且產(chǎn)品的純度極高。利用抗原-抗體之間的高特異性結(jié)合在6 8周的鼠腹中注入人或牛的乳鐵蛋白進行免疫，經(jīng)一系列操作分別出抗體，用抗體和異丙醇活化的親合凝膠混合制得免疫親合色譜。用脫脂牛初乳或常乳作為料液，用洗脫0.2raol/LpH2.7醋酸緩沖液(含0 15mol/LNaCl)洗脫?！惧X貴超濾法是一種根本的膜分別技術(shù)，其原理是超濾法依據(jù)膜孔徑不同可以實現(xiàn)不同分子質(zhì)量和分子外形的大分子物質(zhì)的分別，格外適合熱敏性的功能性組分的分別。選用孔徑或截留分子量不同的一系列超濾膜，可以以干酪乳清為原料生產(chǎn)Lf 基料。鹽析法和層析法從牛初分別純化乳鐵蛋白并利用電泳和鹽析法和層析法分光光度法檢測其純度和含量所獲得的乳鐵蛋白的分子質(zhì)量為90000U,92%31次凝膠層析的方法。乳樣前期處理：乳樣在鹽析和凝膠層析之前要進展前期處理,即除去脂肪和大量的酪蛋白，乳樣前期處理：物料的前期處理方法根本一樣承受穎牛初乳通過離心脫去脂肪〔4°C,3000r/min>30min〕得到脫脂乳，將脫脂乳lmol/L鹽酸溶液調(diào)整脫脂乳的pH值到4 6〔酪蛋白的等電點〕,室溫放置30min,離心除去酪蛋白〔4°C、衆(zhòng)噌鎳減普”得到的上清就是我們需要的乳3鹽析：選用硫酸胺沉淀以除去分子量比較小的蛋白，將30%的飽和硫酸鞍沉淀30min后,4°C4000r/miri40min;50%的飽和硫酸鞍沉30[01.11后，4°〔34000r/min離心40rain,除去免疫球蛋白沉淀，將得到的上清液用85%30mino此時需在PH8.5的狀況下，4°C4000r/min,離心40mino此時收集沉淀，并用蒸憾水溶解。為LF,選用sephadex-G-100對LF進展分別和純化。將透析后的乳清ImL U 參與平衡過的凝膠層析柱，Z3在20C條件下以0. 1=12mL/min的流速進展洗脫，洗脫液選用pH7 4的PBs〔Nacl含量8g/1000mL〕,待消滅峰值后收集洗脫液，每管收ImL。LF 的鑒定承受非連續(xù)性SDS- 電泳對脫脂乳和鹽析分別得到的上清液以及凝膠層析的洗脫產(chǎn)物進展檢測。釆用分光光度法對凝膠層析所得到的乳鐵蛋白的濃度進展測定。結(jié)果與為由于LF的pH為7 0-8.0,所以本試驗?zāi)z層析選用的洗脫液為pH7.4 PBS,pH范圍內(nèi)

4Y.0X04均可LF11

■2LF第SDS-PAGF金垛■

WMO10BRD4Il .九 3 4：S?U；Si??顯LF含量較低，但是LF成分含量卻很低，可以無視，樣品純度比較高經(jīng)SDS-電泳檢測僅消滅一條可見的區(qū)帶，相對分子9000U,LF的92%,LF23顯示樣品的吸取峰峰值LF含量較高,但是樣品不純，含有其他成SDS-2樣品中含有兩種3IV則說明樣品的SDS-電泳檢測可見條帶格外不清楚.OD：分光光度法OD釆用分光光度法測定LF濃度,首先利用純度92%LF溶液在400-650nm m3mnaa牧475nm波長產(chǎn)生特征吸收峰(見3)475nmC與吸A之間關(guān)系的線性回歸方程，如圖四，得方程為:c二827.49A+5.7315

=0.9954)。4A475值未能到達一般分光光度法的線性范圍(0.1-0.7)oA475LF100%LF的A4750.57oLF的鐵飽和度越低,A4A475LFA4750.116,則質(zhì)量濃度為101.73g/ml.4I.F的槨冷曲拔鑒于分光光度法快速，簡便，對儀器設(shè)