基于納米混懸技術(shù)的難溶性中藥

有效部位給藥系統(tǒng)的研究課題支持國家新藥創(chuàng)制重大專項(xiàng)〔2021ZX09103-349〕內(nèi)容提要引言1實(shí)驗(yàn)部分2全文結(jié)論3致謝4引言納米混懸給藥系統(tǒng)〔Nanosuspension，簡稱NS〕物理加工減小粒徑，增大比表面積特殊性質(zhì)較大的溶解性高透過性強(qiáng)吸附性明顯優(yōu)勢增加吸收速度和吸收率提高局部聚集濃度，減少毒副作用延長作用時(shí)間根據(jù)需求進(jìn)行表面修飾引言據(jù)統(tǒng)計(jì)，中藥藥效物質(zhì)中約有50%為水難溶性藥物。難溶性中藥有效部位瓶頸問題為難溶性中藥有效部位納米制劑提供示范提升民族醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)產(chǎn)生巨大社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益

提高生物利用度，增強(qiáng)臨床療效NS引言波棱瓜子為葫蘆科植物波棱瓜〔Herpetospermumcaudigerum)的枯燥成熟種子，具有清熱解毒，去火降熱，助消化等成效。總木脂素活性部位波棱瓜子臨床用途赤巴病、黃疸型肝炎、膽囊炎、消化不良等。結(jié)構(gòu)分析苯并呋喃木脂素類成分。篩查方法

抗鴨乙肝病毒實(shí)驗(yàn)2.2.15細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)抗小鼠急性肝損傷實(shí)驗(yàn)BCSⅡ類難溶性藥物引言

主要化學(xué)成分結(jié)構(gòu)式波棱酮(Herpetone)波棱素(Herpetin)波棱芴酮(Herpetfluorenone)

波棱酚(Herpetenol)波棱甲素(Herpetrione)引言技術(shù)路線總木脂素納米混懸劑制備工藝研究固體化研究體外溶出度考察體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究藥效學(xué)研究粉末穩(wěn)定性考察形態(tài)學(xué)考察、粒徑和多分散度測定再分散性評價(jià)波棱瓜子提取純化工藝研究實(shí)驗(yàn)局部HTL的制備HTL-NS的制備HTL-NS的固體化研究HTL-NS的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究HTL-NS的藥效學(xué)研究主要內(nèi)容HTL的制備一.評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的建立HPLC法出膏率=所得膏率/藥材的投入量×100%波棱甲素得率=干膏中波棱甲素的含量/藥材中波棱甲素的含量×100%波棱甲素的含量出膏率波棱甲素得率HTL的制備二、提取工藝的考察1.吸水率的考察方法：藥材粗粉10倍量水浸泡每隔30min觀察1次收集未被吸收的水液直至完全浸透結(jié)果：波棱瓜子藥材的吸水率為210%。HTL的制備2.正交試驗(yàn)優(yōu)化提取條件

以波棱甲素含量為指標(biāo)，考察溶劑用量、提取時(shí)間、乙醇濃度、提取次數(shù)四個(gè)因素，三個(gè)水平。因素ABCD水平溶劑用量（倍）提取時(shí)間（h）乙醇濃度（%）提取次數(shù)（次）151701272802393903表1提取因素水平

HTL的制備試驗(yàn)編號ABCD波棱甲素含量(mg/g生藥)111113.62212225.09313335.53421235.27522314.02623125.19731325.08832135.18933214.16K14.7474.6574.6633.933K24.8274.7634.8405.120K34.8074.9604.8775.327R0.0800.3030.2141.394表2HTL提取工藝正交試驗(yàn)表HTL的制備方差來源自由度偏差平方和F比F值顯著性A20.0101.00019.000B20.14214.200C20.0787.800D23.392339.200*誤差20.010表3HTL提取工藝正交試驗(yàn)方差分析表

從直觀分析和方差分析結(jié)果可以看出，四個(gè)影響因素的主次順序?yàn)镈>B>C>A，其中D有顯著性意義。最正確組合為A2B3C3D3，即7倍量的90%乙醇提取3次，每次3小時(shí)?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)中降低本錢、生產(chǎn)效率等因素，確定最正確提取工藝為A1B1C2D3，即5倍量的80%乙醇提取3次，每次1小時(shí)。HTL的制備3.提取工藝的驗(yàn)證分別稱取波棱瓜子藥材粗粉100g，共6份，其中三份按正交試驗(yàn)所得的最正確制備工藝(A2B3C3D3)，另外三份按次最正確制備工藝(A1B1C2D3)。濾過，合并濾液，回收乙醇，65℃真空枯燥。表4驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

工藝條件A2B3C3D3A1B1C2D3藥材投量（g）100100稠膏得量（g）8.148.89出膏率（%）8.148.89波棱甲素含量（mg/g生藥）5.205.15HTL的制備4.波棱瓜子藥材中波棱甲素提取率的考察取波棱瓜子藥材粗粉100g，按A1B1C2D3提取；另取波棱瓜子藥材粗粉5.0g，按質(zhì)控分析方法提取。分別測定波棱甲素的含量，計(jì)算波棱甲素的提取率。表5波棱甲素提取率的考察結(jié)果提取方法波棱甲素含量（mg/g生藥）波棱甲素提取率（%）A1B1C2D35.1587.88質(zhì)控方法5.86結(jié)果顯示，該提取工藝對波棱瓜子藥材中的波棱甲素提取率較高，工藝可行。HTL的制備三、精制純化工藝的考察1.色素工藝的考察

波棱瓜子藥材提取液中含有大量的葉綠素，其在冷乙醇溶液中的溶解度較小，放置過程中會(huì)大量析出。6h12h24hHTL的制備2.除油工藝的考察波棱瓜子藥材提取液中含有大量的脂肪油，和本品的功能主治無關(guān)，而且潤腸致瀉，必須將之除去。通過靜態(tài)放置試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該脂肪油密度比水小，通過靜置后油水別離效果很好。因此，考察不同靜置時(shí)間對除油效果的影響。結(jié)果說明，靜置12小時(shí)后油水別離效果最好。波棱瓜子乙醇提取液過濾，回收乙醇至無醇味靜置2小時(shí)靜置6小時(shí)靜置12小時(shí)HTL的制備3.別離純化工藝的考察

為減少服用劑量，同時(shí)利于枯燥、粉碎、減少吸濕、潮解及成型等問題，需對乙醇提取液進(jìn)行純化。由于目標(biāo)成分是帶有酚羥基的木脂素類化合物，因此，本研究對堿溶酸沉和萃取兩種方法進(jìn)行了考察，結(jié)果說明用乙酸乙酯萃取的方法較好。HTL的制備4.精制純化工藝的驗(yàn)證方法：波棱瓜子粗粉乙醇提取液濃縮液靜置24小時(shí)后，過濾，濃縮至無醇味浸膏靜置12小時(shí)后，分去油層乙酸乙酯溶液1倍量乙酸乙酯萃取4次HTL50℃減壓濃縮枯燥HTL的制備表6驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)批次生藥量（g）干膏量（g）出膏率（%）波棱甲素得率（%）1100030.073.0184.212100027.442.7482.683100025.352.5483.48平均值100025.272.5383.46結(jié)果顯示，該精制純化工藝穩(wěn)定可行。HTL的制備四、HTL質(zhì)量控制研究〔1〕總木脂素的含量測定；〔2〕波棱甲素的含量測定?！?〕枯燥失重；〔2〕熾灼殘?jiān)７椒▍⒄罩袊幍?005版。棕色粉末，味苦。以羧甲基纖維素鈉為粘合劑的硅膠板展開劑：二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇(3:2:0.2)顯色劑：20%硫酸乙醇溶液性狀檢查鑒別含量測定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)HTL的制備五、HTL固體狀態(tài)的穩(wěn)定性考察稱取HTL原料藥約1g，置于量瓶中。分別于第0、1、2、4、6個(gè)月取樣，采用HPLC法測定波棱甲素的含量。圖1穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果結(jié)果顯示，HTL固形物中波棱甲素的含量在6個(gè)月內(nèi)根本保持不變，理化性質(zhì)穩(wěn)定。HTL-NS的制備研磨法微乳法納米沉淀法高壓乳勻法優(yōu)點(diǎn)

適用范圍廣，粒徑分布均勻，且適于熱不穩(wěn)定性藥物。缺點(diǎn)在制備過程中會(huì)出現(xiàn)碾磨介質(zhì)的溶蝕、脫落，使納米混懸劑中含有一定量的碾磨介質(zhì)。

優(yōu)點(diǎn)制備過程簡單，不需要特殊設(shè)備。缺點(diǎn)不適用于既不溶于水也不溶于有機(jī)試劑的藥物，同時(shí)還存在有機(jī)溶劑殘留及安全性問題。

優(yōu)點(diǎn)重復(fù)性好，粒徑均勻，適用于穩(wěn)定性較差的藥物。缺點(diǎn)制備過程需要大量有機(jī)溶劑，且含藥量低，不適用于大生產(chǎn)。無需使用有機(jī)試劑，前三種方法的優(yōu)點(diǎn)均具有，還可適用于制備注射用的無菌納米混懸劑，從而被認(rèn)為是NS較理想的制備方法。制備方法HTL-NS的制備1.制備工藝的初步確定

采用高壓乳勻法制備HTL-NS。先將波棱瓜子總木脂素原料藥和外表活性劑參加適量蒸餾水中，充分?jǐn)嚢杌靹?，然后進(jìn)行高速探頭超聲乳化，最后高壓乳勻，得HTL-NS。一、HTL-NS制備工藝的考察HTL-NS的制備2.外表活性劑的考察為了得到穩(wěn)定的納米混懸劑，防止納米粒子的凝聚和增大，制備過程中需參加一些外表活性劑。外表活性劑的種類、用量及用法均會(huì)不同程度影響納米粒的粒徑、分散性和穩(wěn)定性，因此，制備不同的納米粒宜選擇相適宜的外表活性劑。HTL-NS的制備〔1〕外表活性劑種類的篩選表7外表活性劑種類的篩選表面活性劑平均粒徑（nm）體系觀察Poloxamer560放置后沉淀于杯底吐溫80621顆粒間易發(fā)生絮凝卵磷脂780制劑失敗SDS372放置后體系能保持較長時(shí)間穩(wěn)定PVPK30410放置后體系能保持較長時(shí)間穩(wěn)定PVA659放置后沉淀于杯底本研究以平均粒徑和體系觀察為指標(biāo)，考察了Poloxamer、吐溫80、卵磷脂、SDS、PVPK30、PVA等常用外表活性劑。HTL-NS的制備〔2〕外表活性劑用法的考察為了進(jìn)一步優(yōu)化外表活性劑的使用，充分發(fā)揮其作用，本課題還對外表活性劑的使用方法經(jīng)行了研究，考察了SDS和PVPK30在單用和合用時(shí)，對粒徑和體系穩(wěn)定性的影響。結(jié)果說明，將兩種輔料合用，制備HTL-NS時(shí)效果更佳，粒徑更小，且體系更穩(wěn)定。HTL-NS的制備3.高壓乳勻參數(shù)的考察

在HTL-NS的制備過程中，除了外表活性劑的使用，高壓乳勻過程也是影響粒徑和體系穩(wěn)定性的一個(gè)重要因素。本課題以粒徑和體系觀察為指標(biāo)，對高壓乳勻的壓力和循環(huán)次數(shù)進(jìn)行了考察。結(jié)果說明，在1000bar壓力條件下高壓乳勻10次，制備得到的HTL-NS效果最正確。HTL-NS的制備4.處方設(shè)計(jì)及優(yōu)化以粒徑為指標(biāo)，考察主藥與輔料的比例、SDS與PVPK30的比例，主藥與蒸餾水的比例三個(gè)因素，三個(gè)水平。因素ABC水平主藥：輔料SDS：PVPK30主藥：蒸餾水110:11:11:20220:32:31:3035:11:31:40表8因素水平表

HTL-NS的制備123393123823137213261322532124333132221211111DCBA試驗(yàn)編號3.33311.000101.000167.667R383.333376.333420.000442.667K3383.000382.667319.000275.000K2380.000387.333407.333428.667K1479386463319204302462367457平均粒徑（nm）表9正交試驗(yàn)表HTL-NS的制備方差來源自由度偏差平方和F比F值顯著性A251921.5562567.57819.000*B218164.222898.241*C2182.8899.044D220.2221.000誤差220.222表10方差分析表

根據(jù)直觀分析和方差分析表可見，三個(gè)因素影響的主次順序?yàn)锳>B>C，其中A、B的影響有顯著意義，最正確組合為A2B2C3。考慮到蒸餾水參加量過大，會(huì)影響枯燥效率，同時(shí)主藥：蒸餾水的影響沒有顯著意義，因此選擇A2B2C1為制備HTL-NS的最正確工藝，即主藥：輔料為20:3，SDS：PVPK30為2:3，主藥：蒸餾水為1:20。HTL-NS的制備5.制備工藝的驗(yàn)證制備工藝：HTLSDS、PVPK30參加適量蒸餾水，充分?jǐn)嚢杈鶆?000r/min高速探頭超聲乳化1000bar壓力下高壓乳勻10圈HTL-NSHTL-NS的制備按上述工藝制備三批HTL-NS，測定平均粒徑及多分散度指數(shù)。表11HTL-NS三批驗(yàn)證結(jié)果試驗(yàn)批號平均粒徑(nm)PdI1239.90.1402237.70.1543241.60.118三批驗(yàn)證結(jié)果顯示，其平均粒徑的范圍在200-300nm之間，PdI的平均值為0.137，粒徑大小符合標(biāo)準(zhǔn)，且分布均勻，說明該工藝穩(wěn)定可行，重現(xiàn)性好。HTL-NS的制備1.外表形態(tài)觀察方法：

取HTL-NS加適量蒸餾水稀釋后，滴加至錫箔紙上，常溫下放置，待溶劑揮干后，于掃描鏡下觀察其形態(tài)并拍攝照片。二、HTL-NS形態(tài)學(xué)考察由圖可見，按照最佳工藝制備的HTL-NS，納米在掃描電鏡下呈不規(guī)則球形，大小均勻。HTL-NS的制備2.粒徑及多分散度的測定

方法：

取HTL-NS適量，加蒸餾水稀釋后，放入粒徑測定儀中，進(jìn)行粒徑和多分散度的測定。結(jié)果表明，HTL-NS的平均粒徑為239.9nm，多分散度指數(shù)為0.140。說明按照最佳工藝制備的HTL納米粒粒徑小，粒徑分布均勻，范圍窄。HTL-NS的固體化研究HTL-NS為溶液，屬于熱力學(xué)不穩(wěn)定體系，物理穩(wěn)定性存在擔(dān)憂，另服用攜帶不方便，非常必要將其固體化，以提高穩(wěn)定性的同時(shí)，方便患者使用。研究發(fā)現(xiàn)，納米混懸液固體化后常出現(xiàn)粒徑明顯變大、粒子發(fā)生聚合、儲存過程老化等再分散性差問題。因此，固體化再分散后溶液是否還呈納米狀態(tài)，是關(guān)鍵的科學(xué)技術(shù)問題，也是制約藥物納米開展的瓶頸問題。HTL-NS的固體化研究一、枯燥方法的選擇噴霧枯燥真空枯燥冷凍枯燥真空干燥：操作簡直，干燥速率快，但呈現(xiàn)嚴(yán)重硬團(tuán)聚集現(xiàn)象；噴霧干燥：粒徑仍呈納米狀態(tài)，但成本較高；冷凍干燥：操作簡單，具有良好的復(fù)原性?？疾旖Y(jié)果√HTL-NS的固體化研究二、保護(hù)劑的選擇采用冷凍枯燥后，雖然粒徑仍呈納米狀態(tài)，但是固體化前后粒徑變化較大，且外觀不好。為了改善這一情況，那么需要在枯燥前參加適量的保護(hù)劑。表12保護(hù)劑的評價(jià)方法及標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)指標(biāo)操作方法評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)外觀取各處方凍干品，通過肉眼觀察和觸摸，對凍干品整體形態(tài)、色澤、質(zhì)地等進(jìn)行評價(jià)。以色澤均勻，表面光潔，無花斑，不塌陷，不皺縮，維持原體積，可整塊脫落但不散碎，質(zhì)地細(xì)膩者為佳。粒徑變化差值按粒徑測定方法對固體化前后的粒徑進(jìn)行測定，計(jì)算粒徑變化差值。以固體化前后粒徑變化值不超過50nm為佳。再分散性取各處方凍干品，加入蒸餾水20ml，振搖分散。能在較少的振搖次數(shù)下，很快分散得到均勻的HTL-NS混懸液者為佳。HTL-NS的固體化研究1.保護(hù)劑的考察按最正確工藝制備HTL-NS，分別參加不同濃度的葡萄糖、甘露醇、乳糖、山梨醇作保護(hù)劑，充分混勻后，進(jìn)行冷凍枯燥?？菰锝Y(jié)束后，按上述標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評價(jià)。表13各處方凍干品評價(jià)結(jié)果保護(hù)劑濃度外觀粒徑變化差值再分散性葡萄糖5%——+10%15%甘露醇5%++++++10%++++15%++++乳糖5%+++++++10%++++15%++++山梨醇5%—++++10%15%HTL-NS的固體化研究2.凍干HTL-NS的制備工藝驗(yàn)證按最正確工藝制備凍干HTL-NS，測定平均粒徑、多分散度指數(shù)、粒徑變化差值和再分散性。表14凍干HTL-NS三批驗(yàn)證結(jié)果試驗(yàn)批號平均粒徑(nm)PdI粒徑變化差值(nm)再分散性1256.70.22320+++

2262.30.19834+++

3248.90.16729+++

三批驗(yàn)證結(jié)果顯示，平均粒徑范圍在200-300nm之間，多分散度指數(shù)的平均值為0.196，平均粒徑變成差值為28nm，粒徑大小符合納米標(biāo)準(zhǔn)，且分布均勻，固體化前后粒徑變化小，再分散性好，說明最正確工藝穩(wěn)定可行，重現(xiàn)性好。HTL-NS的固體化研究3.凍干HTL-NS的穩(wěn)定性考察按最正確工藝制備凍干HTL-NS三批，常溫下放置3個(gè)月后，測定平均粒徑、多分散度指數(shù)、粒徑變化差值和再分散性。

結(jié)果顯示，3個(gè)月后凍干品納米粒平均粒徑、多分散度指數(shù)和粒徑變化差值均稍有增大，分散性良好，粒徑都在400nm以下。HTL-NS的固體化研究4.HTL-NS的體外溶出度考察〔1〕溶出介質(zhì)的考察在HTL中，大多數(shù)木脂素都含有-OH，因此在酸性溶液中溶解性較差?，F(xiàn)選用pH=6.8的磷酸鹽緩沖液和pH=7.5的磷酸鹽緩沖液兩種不同溶出介質(zhì)進(jìn)行HTL-NS的溶出度比較試驗(yàn)。0102030405060708090100010203040506070t/mindissolution/%PH=7.5PH=6.8結(jié)果顯示，HTL-NS在pH=7.5的磷酸鹽緩沖液的溶出行為較好，故選擇pH=7.5的磷酸鹽緩沖液作為溶出介質(zhì)。HTL-NS的固體化研究〔2〕溶出體積的考察溶出介質(zhì)的體積需符合藥物漏槽條件，即溶出介質(zhì)的量要超過藥物全部溶解時(shí)所需要的介質(zhì)量，至少為藥物溶解用量的三倍以上。同時(shí)還需考慮高效液相色譜法含量測定時(shí)的最低檢測限，故將溶出介質(zhì)的體積定為900ml。HTL-NS的固體化研究〔3〕溶出度測定方法的建立色譜條件：AlltimaC18

色譜柱(5μm，250×4.6mm)；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸水溶液(24:76)；流速：1.0ml/min；檢測波長：240nm；柱溫：30℃。

專屬性考察線性考察

精密度試驗(yàn)回收率試驗(yàn)

穩(wěn)定性試驗(yàn)方法學(xué)考察

在該色譜條件下，波棱甲素得到較好分離，且空白樣品在相同保留時(shí)間處未顯色譜峰，故認(rèn)為無干擾。日內(nèi)RSD為0.37%；日間RSD為0.45%?；貧w方程為:Y＝1312X－2.5414，r＝0.9997，波棱甲素在9.9～148.4μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。供試品溶液在12小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定，RSD為0.19%。平均回收率為101.2%，RSD為1.21%。HTL-NS的固體化研究〔4〕HTL-NS膠囊和HTL物理混合物膠囊的制備取適量枯燥至恒重的固體化HTL-NS粉末分裝到膠囊中，制成HTL-NS膠囊〔每粒含波棱甲素100mg〕；另取適量枯燥至恒重的HTL粉末按制備HTL-NS的處方比例稱取輔料，通過物理混勻后，分裝到膠囊中，制成HTL物理混合物膠囊〔每粒含波棱甲素100mg〕，備用。HTL-NS的固體化研究〔5〕溶出度的測定分別取HTL-NS膠囊和HTL物理混合物膠囊各6粒，量取經(jīng)脫氣處理的pH=7.5磷酸鹽緩沖溶液900ml至溶出杯中，加溫使溶出介質(zhì)溫度在(37±0.5)℃，調(diào)轉(zhuǎn)速為100r/min。將膠囊投入溶出杯內(nèi)，分別于5、10、15、20、30、45、60min時(shí)取樣按外標(biāo)法計(jì)算出供試品溶液的質(zhì)量濃度，并計(jì)算出每粒的溶出度。0102030405060708090100010203040506070t(min)溶出度(%)HTLHTL-NS

結(jié)果顯示，HTL物理混合物膠囊的最大累積溶出率只有38.96%，而HTL-NS膠囊在20min時(shí)的累積溶出率就能達(dá)到87.49%。HTL-NS的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究1.色譜條件色譜柱：AlltimaC18(5μm，250×4.6mm)；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸水溶液(24:76)；流速：1.0ml/min；檢測波長：240nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20μl。一、血藥濃度測定方法的建立2.血漿樣品的處理與測定精密移取血漿0.2mL置于具塞離心管中，參加甲醇沉淀蛋白，渦旋振搖30s，3000r/min離心5min，吸取上清液于40℃用氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)鼌⒓?00μl甲醇溶解，充分渦旋振蕩，3000r/min離心5min，取上清液20μl進(jìn)樣測定。HTL-NS的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究3.專屬性考察ABDC

A.空白B.波棱甲素對照品C.血漿對照品D.HTL-NS血漿濃度由圖可見，血漿中雜質(zhì)和波棱甲素有較好的別離度，血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)無干擾，因此本法有較高的專屬性。HTL-NS的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究4.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以藥物濃度(x)對峰面積(Y)作線性回歸，回歸方程為Y=59.976X－7.296，r=0.9989(n=6)

，波棱甲素血漿濃度在0.297-11.88μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。最低檢測限為0.2μg/ml。

5.精密度試驗(yàn)

血漿中波棱甲素日內(nèi)平均精密度RSD<2.72%(n=5)，日間平均精密度RSD<6.05%(n=3)。

6.回收率試驗(yàn)

高、中、低濃度血漿中波棱甲素的提取回收率均>79%，方法平均回收率為98.6%-101.3%，RSD<3.5%。HTL-NS的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：Wistar大鼠16只，♀、♂各半，(200±20)g，SPF級給藥前禁食12h，不禁水，按體重隨機(jī)分為2組A組：口服灌胃HTL-NSB組：口服灌胃參比制劑HTL給藥劑量：270mg/kg〔以波棱甲素計(jì)算〕取血時(shí)間：0.25、0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、14、16h采集血樣：眼眶后靜脈叢取血保存方式:血樣經(jīng)肝素抗凝后分取血漿，冷藏，備用數(shù)據(jù)處理：3P97藥動(dòng)學(xué)軟件二、給藥方法、樣品采集和數(shù)學(xué)分析HTL-NS的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究三、藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)結(jié)果024681012140246810121416t/hC/ug?ml-1HTL-NSHTLParameterUntiHTL-NSHTLKe1/h0.38500.4921Ka1/h32.05432.3136T1/2(a)h0.02160.2996T1/2(e)h1.80051.4084T(peak)h0.13960.8498Cmaxμg·h-111.15734.8923AUC(0→T)(ug·ml-1)*h30.582915.1023表15波棱甲素大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)表

0→T:HTL-NSfromzeroto14h;HTLfromzeroto10h.

藥時(shí)曲線經(jīng)擬合顯示波棱甲素在大鼠體內(nèi)動(dòng)力學(xué)行為符合一室模型。結(jié)果顯示，HTL原料藥和HTL-NS的藥時(shí)曲線2h后開始呈緩慢的下降趨勢，血藥物濃度分別于10h和14h后低于最低檢測限。與參比制劑相比，HTL-NP的Ka較大，Ke較小，T(peak)縮短了4/5，AUC增大了2倍以上。說明HTL-NS提高了HTL的體內(nèi)生物利用度，有效的解決了HTL難溶性問題。HTL-NS的藥效學(xué)研究1.試驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：Wistar大鼠40只，♀、♂各半，(200±10)g，SPF級按體重隨機(jī)分為4組A組：正常對照組；B組：肝損傷模型組；C組：HTL組；D組：HTL-NS組。造模方法：腹腔注射10%CCl4植物油(按0.5ml/100g體重給予)，每周兩次，連續(xù)給予12周，正常對照組那么給予同體積的生理鹽水。給藥方法：造模同時(shí)每日灌胃給藥一次，C、D組按0.081g/kg(以波棱甲素計(jì))給藥(按0.5ml/100g體重給予)，A、B組灌胃給予同體積的生理鹽水。樣品采集：實(shí)驗(yàn)結(jié)束前，禁食12小時(shí)。取股動(dòng)脈血，3000r/min離心10min，別離血清，測定GPT、GOT、TP、ALB；取肝組織作羥脯氨酸測定，計(jì)算肝膠原蛋白含量，同時(shí)做組織化學(xué)及組織病理學(xué)檢查。一、對四氯化碳致大鼠慢性肝損傷的影響HTL-NS的藥效學(xué)研究2.試驗(yàn)結(jié)果表16對四氯化碳致大鼠慢性肝損傷的影響

組別GPT(U

L-1)GOT(U

L-1)TP(g

L-1)ALB(g

L-1)白/球?qū)φ战M34.21

2.2533.42

4.316.79

0.384.12

0.291.54模型組138.68

25.53##113.22

8.03##5.43

0.95#3.14

0.53##1.37HTL組75.32

18.98**62.98

21.68**6.33

0.963.73

0.69*1.43HTL-NS組60.19

8.68**49.93

8.49**6.68

0.58**4.02

0.56**1.51與正常組比較#p<0.05，##p<0.01；與模型組比較*p<0.05，**p<0.01組別劑量(g/kg)動(dòng)物數(shù)(只)膠原蛋白(mg/g干肝)對照組1014.15

2.96模型組1042.88

5.44##HTL組0.0811031.60

2.64**HTL-NS組0.0811020.33

1.68**與模型組比較，*p<0.05，**p<0.01表17對大鼠肝膠原蛋白含量的影響HTL-NS的藥效學(xué)研究正常對照組：肝組織正常結(jié)構(gòu)；B.模型對照組：肝臟較大面積壞死，假小葉形成；C.HTL-NS組：少量纖維增生；D.HTL組：膠原纖維不明顯。

結(jié)果顯示，HTL和HTL-NS均可抑制多次注射CCl4引起的大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶的升高、總蛋白和白蛋白的降低，減少肝膠原蛋白的含量。HTL組和HTL-NS組比較，HTL-NS對CCl4所致的大鼠慢性肝損傷的治療作用較HTL好。HTL-NS的藥效學(xué)研究1.試驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：昆明種小鼠40只，♀、♂各半，(20±2)g，SPF級按體重隨機(jī)分為4組A組：正常對照組；B組：肝損傷模型組；C組：HTL組；D組：HTL-NS組。給藥方法：C、D組按0.117g/kg(以波棱甲素計(jì))給藥，每天2次，連續(xù)給藥7天，A、B組灌胃給予同體積的生理鹽水。造模方法：連續(xù)給藥7天后，腹腔注射D-GalN800mg/kg(按0.2ml/10g體重給予)，正常對照組那么給予同體積的生理鹽水。樣品采集：造模后20小時(shí)，小鼠摘眼球取血，測血清GPT、GOT值，并取肝組織作病理學(xué)檢查。二、對D-GalN所致小鼠急性肝損傷的影響HTL-NS的藥效學(xué)研究2.試驗(yàn)結(jié)果表18對D-GalN致小鼠急性肝損傷的影響

組別動(dòng)物數(shù)(只)GPT(U

L-1)GOT(U

L-1)對照組1015.30

1.0220.56

2.96模型組1068.18

11.38##67.55

5.47##HTL組1054.95

16.17*54.88

12.82*HTL-NS組1028.83

5.55**33.38

11.03**與正常對照組比較，#p<0.05,##p<0.01；與模型組比較，*p<0.05，**p<0.01正常對照組：正常肝組織結(jié)構(gòu)；模型對照組：局部肝細(xì)胞腫脹、變性；HTL-NS組：個(gè)別肝細(xì)胞腫脹；HTL組：肝細(xì)胞輕度水樣變性。結(jié)果表明，