堿裂解法抽提大腸桿菌質(zhì)粒堿裂解法抽提大腸桿菌質(zhì)粒第1頁1、試驗?zāi)繕?biāo)：學(xué)習(xí)與掌握堿裂解法抽提大腸桿菌質(zhì)粒DNA原理與方法堿裂解法抽提大腸桿菌質(zhì)粒第2頁2、試驗原理：

堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA變性與復(fù)性差異而到達(dá)分離目標(biāo)。堿裂解法抽提大腸桿菌質(zhì)粒第3頁3、試驗步驟及各步注意事項1. 取1.4ml大腸桿菌培養(yǎng)液1rpm離心2min，棄上清，搜集菌體。

注意點(diǎn)：上清為培養(yǎng)基，必須盡可能傾倒?jié)崈?，并在吸水紙上吸干，如有較多培養(yǎng)基殘留可能會影響后續(xù)試驗。堿裂解法抽提大腸桿菌質(zhì)粒第4頁堿裂解法抽提大腸桿菌質(zhì)粒第5頁堿裂解法抽提大腸桿菌質(zhì)粒第6頁堿裂解法抽提大腸桿菌質(zhì)粒第7頁堿裂解法抽提大腸桿菌質(zhì)粒第8頁堿裂解法抽提大腸桿菌質(zhì)粒第9頁2. 加100μl溶液I，使菌體充分懸浮，室溫靜置3min。

注意點(diǎn)：必須充分混勻至看不見沉淀，可用移液器吹打或者用混勻器振蕩。堿裂解法抽提大腸桿菌質(zhì)粒第10頁堿裂解法抽提大腸桿菌質(zhì)粒第11頁堿裂解法抽提大腸桿菌質(zhì)粒第12頁堿裂解法抽提大腸桿菌質(zhì)粒第13頁3. 加入200μl溶液II，溫和上下顛倒2-3次，溶液轉(zhuǎn)變?yōu)槌吻逋该鳌?/p>

注意點(diǎn)：不可猛烈振蕩。堿裂解法抽提大腸桿菌質(zhì)粒第14頁堿裂解法抽提大腸桿菌質(zhì)粒第15頁堿裂解法抽提大腸桿菌質(zhì)粒第16頁4. 加入150μl溶液III，上下顛倒混勻數(shù)次，靜置2-3min。

注意點(diǎn)：不可猛烈振蕩，此時應(yīng)出現(xiàn)白色沉淀。5. 1rpm離心5min。堿裂解法抽提大腸桿菌質(zhì)粒第17頁堿裂解法抽提大腸桿菌質(zhì)粒第18頁堿裂解法抽提大腸桿菌質(zhì)粒第19頁堿裂解法抽提大腸桿菌質(zhì)粒第20頁堿裂解法抽提大腸桿菌質(zhì)粒第21頁6. 取上清，加等體積（400μl）酚/氯仿/異戊醇，充分混勻，室溫，1rpm離心5min。

注意點(diǎn)：酚氯仿有腐蝕性，蓋嚴(yán)離心管蓋，防止接觸酚氯仿，如接觸馬上用水沖洗。堿裂解法抽提大腸桿菌質(zhì)粒第22頁堿裂解法抽提大腸桿菌質(zhì)粒第23頁堿裂解法抽提大腸桿菌質(zhì)粒第24頁堿裂解法抽提大腸桿菌質(zhì)粒第25頁7. 吸上層水相，再加1ml(約2.5倍體積）預(yù)冷無水乙醇，混勻。

注意點(diǎn)：一定防止吸到中間沉淀及下層酚氯仿。寧可損失一定上清。堿裂解法抽提大腸桿菌質(zhì)粒第26頁堿裂解法抽提大腸桿菌質(zhì)粒第27頁堿裂解法抽提大腸桿菌質(zhì)粒第28頁堿裂解法抽提大腸桿菌質(zhì)粒第29頁8. 4℃，1rpm離心10min。

9. 棄上清，加入0.5ml70％乙醇，4℃，1rpm離心5min。10. 棄上清，沉淀自然干燥10min后，加20μl無菌水溶解。

注意點(diǎn)：棄上清時盡可能將酒精傾倒?jié)崈簦⒁獠灰獙⒊恋項壢?。堿裂解法抽提大腸桿菌質(zhì)粒第30頁堿裂解法抽提大腸桿菌質(zhì)粒第31頁堿裂