納米技術(shù)與基因疫苗

的體內(nèi)運(yùn)送1疫苗1.1疫苗簡(jiǎn)介是將病原微生物（如細(xì)菌、立克次氏體、病毒等）及其代謝產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)人工減毒、滅活或利用轉(zhuǎn)基因等方法制成的用于預(yù)防傳染病的自動(dòng)免疫制劑。疫苗能刺激動(dòng)物體免疫系統(tǒng)，引起特異性免疫反應(yīng)，產(chǎn)生一定的保護(hù)物質(zhì)，如免疫激素、活性生理物質(zhì)、特殊抗體等；當(dāng)動(dòng)物再次接觸到這種病原菌時(shí)，動(dòng)物體的免疫系統(tǒng)便會(huì)依循其原有的記憶，制造更多的保護(hù)物質(zhì)來(lái)阻止病原菌的傷害。1.2疫苗的種類(lèi)①人工主動(dòng)免疫持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，廣泛用于預(yù)防傳染性疾病。如滅活疫苗，減毒活疫苗，類(lèi)毒素；②人工被動(dòng)免疫持續(xù)時(shí)間短，主要用治療和緊急預(yù)防，如抗毒素，人免疫球蛋白制劑，細(xì)胞因子制劑，單克隆抗體制劑；③新型疫苗主要是基因工程疫苗。如重組抗原疫苗，重組載體疫苗，DNA/RNA疫苗，轉(zhuǎn)基因植物疫苗。2基因疫苗2.1基因疫苗簡(jiǎn)介基因疫苗又稱(chēng)核酸疫苗或DNA疫苗，是在基因治療技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的。將編碼某種抗原蛋白的外源基因(DNA或RNA)與載體重組后,導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞內(nèi),使帶有目的基因通過(guò)宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成抗原蛋白,誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生針對(duì)該抗原蛋白的抗體，并引起特異的免疫應(yīng)答以達(dá)到預(yù)防和治療的目的2.2發(fā)展1990年Wolff等在進(jìn)行基因治療試驗(yàn)時(shí)，以裸DNA注射作對(duì)照，結(jié)果意外發(fā)現(xiàn)裸DNA可被骨骼肌細(xì)胞吸收并表達(dá)出外源性蛋白。1992年Tang等首次證明經(jīng)基因免疫產(chǎn)生的外源性蛋白質(zhì)——人生長(zhǎng)激素可刺激小鼠免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性抗體，而且加強(qiáng)免疫后抗體效價(jià)增加，從而宣告基因疫苗的誕生。激活免疫系統(tǒng)的詳細(xì)機(jī)制尚不十分清楚。一般認(rèn)為，含病原體抗原基因的核酸疫苗被導(dǎo)入宿主骨骼肌細(xì)胞或皮膚細(xì)胞后，可在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)病原體的蛋白質(zhì)抗原，經(jīng)加工后形成的多肽抗原可與宿主細(xì)胞MHCⅠ類(lèi)和Ⅱ類(lèi)分子結(jié)合，并被提呈給宿主的免疫識(shí)別系統(tǒng),從而可引起特異性體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。2.3作用機(jī)制2.4與傳統(tǒng)疫苗相比的優(yōu)點(diǎn)制備簡(jiǎn)單，容易大量生產(chǎn)，成本低；非常穩(wěn)定，易于貯存和運(yùn)輸，使用方便；質(zhì)粒DNA無(wú)免疫原性，不會(huì)像重組疫苗那樣誘發(fā)針對(duì)載體的自身免疫反應(yīng)；在宿主體內(nèi)的存在時(shí)間長(zhǎng)，持續(xù)表達(dá)產(chǎn)生抗原蛋白，不斷刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生長(zhǎng)程免疫，免疫效果可靠；用核心蛋白保守DNA序列制備的基因疫苗對(duì)病原體的各變異亞型都可產(chǎn)生免疫應(yīng)答，從而避免了因病原體變異而造成的免疫逃避問(wèn)題；一個(gè)質(zhì)粒載體可克隆多個(gè)抗原基因組成多價(jià)苗，故一種基因疫苗可預(yù)防多種疾病。2.5DNA疫苗領(lǐng)域的研究進(jìn)展(1)B型肝炎B型肝炎病毒(HBV)的DNA疫苗是目前被研究得最詳細(xì)的DNA疫苗之一.現(xiàn)在B型肝炎疫苗的成分是以基因工程技術(shù)合成的S抗原制成，一般而言，這種疫苗的效果相當(dāng)不錯(cuò)。但是免疫力正常的人仍有少于5%的人無(wú)法產(chǎn)生足夠的抗體。研究發(fā)現(xiàn)，

用肌肉注射B型肝炎病毒DNA疫苗即可產(chǎn)生較好的免疫保護(hù)，同時(shí)產(chǎn)生抗HBV的抗體及細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)。

除用在預(yù)防B型肝炎病毒感染，也有人用B型肝炎病毒DNA疫苗治B型肝炎，在B型肝炎病毒轉(zhuǎn)殖鼠的研究當(dāng)中，B型肝炎病毒DNA疫苗成功地誘發(fā)老鼠產(chǎn)生相應(yīng)抗體，不但清除血液中的B型肝炎病毒表面抗原，肝細(xì)胞中B型肝炎病毒的mRNA也消失，同時(shí)并不會(huì)對(duì)肝細(xì)胞本身造成傷害。關(guān)于基因免疫的研究在世界范圍內(nèi)廣泛展開(kāi)，所涉及的范圍包括人和動(dòng)物的各種細(xì)菌性疾病、病毒性疾病、寄生蟲(chóng)病及腫瘤性疾病。目前，在醫(yī)學(xué)上針對(duì)結(jié)核桿菌、艾滋病病毒、流感病毒等的基因疫苗已進(jìn)入臨床階段；而針對(duì)乙型，丙型，戊型肝炎病毒、狂犬病病毒牛皰疹病毒、人乳頭瘤病毒感染及相關(guān)癌癥、乳腺癌、肺癌、前列腺癌等的核酸疫苗也正處于研究和開(kāi)發(fā)之中。(2)流行性感冒病毒(Influenza)流行性感冒病毒的一個(gè)重要特征是它會(huì)不斷的突變,主要是其表面蛋白會(huì)不斷轉(zhuǎn)變，出現(xiàn)新的病毒株，進(jìn)而導(dǎo)致大規(guī)模的傳染?，F(xiàn)在的去活性疫苗注射必須預(yù)測(cè)可能的病毒株，然后再進(jìn)疫苗的制造。一旦出現(xiàn)預(yù)測(cè)錯(cuò)誤，或有新的病毒株出現(xiàn)，則現(xiàn)有的疫苗可能會(huì)無(wú)效。流行性感冒病毒的核蛋白(nucleoproteins,NP)相對(duì)比較少會(huì)有突變，可惜在自然感染下，核蛋白本身并不足以產(chǎn)生足夠的免疫。針對(duì)流行性感冒病毒會(huì)不斷突變的問(wèn)題，曾經(jīng)有人用含有流行性感冒病毒核蛋白基因的DNA疫苗，在鼠體內(nèi)誘發(fā)出針對(duì)A型流行性感冒病毒的保護(hù)。如果能應(yīng)用在人體身上，將是流行性感冒的預(yù)防工作上一個(gè)很重要的突破。(3)丙型肝炎DNA疫苗1996年，Major等將編碼HBV核心蛋白的主要抗原決定簇基因與HBV主要蛋白基因融合，構(gòu)建了重組HCVDNA疫苗，免疫接種小鼠后，成功地誘導(dǎo)了對(duì)兩種抗原的免疫應(yīng)答并檢測(cè)到了兩種病毒的抗體。同年，TobushigeK等將HCV核心蛋白基因的。DNA構(gòu)建核酸疫苗后，免疫BALB／C小鼠后也產(chǎn)生了針對(duì)核心蛋白的免疫應(yīng)答。(4)瘧疾DNA疫苗

1994年Sedegah等構(gòu)建的質(zhì)粒DNA中含有編碼尤氏瘧原蟲(chóng)環(huán)子孢子蛋白(PyCSP)的基因。該疫苗與目前試驗(yàn)中的疫苗(輻射處理的子孢子)相比，能誘導(dǎo)更高水平的抗PyCSP抗體和CTL，并使16只免疫小鼠中的9只獲得了對(duì)瘧原蟲(chóng)感染的防御作用。最近研究表明瘧疾基因疫苗有可能成為最早用于人類(lèi)的基因疫苗。直接注射法：質(zhì)粒DNA直接從肌肉、皮內(nèi)、皮下、粘膜、靜脈內(nèi)注射。肌內(nèi)注射是最為常用的免疫給藥途徑，但是DNA疫苗在這種情況下易被降解，利用率低。2.6基因疫苗的使用方法基因槍轟擊法：將質(zhì)粒DNA包被在金微粒子表面，用基因槍將包被DNA的金微粒子高速穿入組織細(xì)胞。這種方法效率高，免疫應(yīng)答強(qiáng)烈，但操作復(fù)雜，需特殊設(shè)備。

細(xì)菌或病毒攜帶法：病毒載體對(duì)大多數(shù)靶細(xì)胞具有高效的轉(zhuǎn)染率，但有制備復(fù)雜、有免疫原性、存在安全隱患等不足。口服、噴鼻或滴鼻法：能刺激粘膜免疫，對(duì)于經(jīng)粘膜感染的疾病的防護(hù)效果好。但是胃腸道和鼻腔的代謝酶、pH會(huì)使質(zhì)粒DNA降解。適宣的給藥系統(tǒng)，減少藥物的降解、提高細(xì)胞吸收非常重要2.7目前基因疫苗在使用中待解決的問(wèn)題如何增強(qiáng)DNA疫苗的免疫效果等問(wèn)題是當(dāng)前DNA疫苗研究的國(guó)際熱點(diǎn)問(wèn)題。根據(jù)DNA疫苗的體內(nèi)免疫機(jī)理，吞噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞(AntigenPresentingCells，APCs)在DNA疫苗的轉(zhuǎn)染、表達(dá)、提呈過(guò)程中發(fā)揮著極為重要的作用。理想的基因疫苗給藥系統(tǒng)應(yīng)滿(mǎn)足以下幾個(gè)方面：(1)保護(hù)基因一直到達(dá)靶細(xì)胞；(2)容易穿過(guò)細(xì)胞膜；(3)容易從內(nèi)涵體釋放；(4)保護(hù)基因不被核酸酶降解；(5)容易與基因解離。納米技術(shù)是理想的答案嗎？3納米技術(shù)3.1納米技術(shù)的簡(jiǎn)介在納米尺寸上對(duì)物質(zhì)和材料進(jìn)行研究處理的技術(shù)稱(chēng)為納米技術(shù)。納米技術(shù)本質(zhì)上是一種用單個(gè)原子、分子制造物質(zhì)的技術(shù)。3.2納米材料的特點(diǎn)表面效應(yīng)、小尺寸/量子尺寸效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)等。納米材料的光學(xué)、磁學(xué)、力學(xué)、熱學(xué)、電學(xué)以及化學(xué)性質(zhì)和大塊固體時(shí)相比將會(huì)有顯著的不同。納米管納米樹(shù)納米花金納米顆粒3.2.1納米材料的表面效應(yīng)指納米粒子的表面原子數(shù)與總原子數(shù)之比隨粒徑變小而急劇增大后所引起的性質(zhì)上的變化。納米顆粒的表面能高、活性強(qiáng)造成的性質(zhì)變化高表面活性→交聯(lián)或吸附性強(qiáng)吸附在細(xì)胞膜上胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞吸附藥物/質(zhì)粒DNA納米粒納米粒-藥物/DNA復(fù)合物納米載體-綠色熒光蛋白報(bào)道基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞3.2.2小尺寸/量子尺寸效應(yīng)指由于顆粒尺寸變小所引起的宏觀物理性質(zhì)的變化。光學(xué)效應(yīng)如不同大小的金顆粒和銀顆粒具有不同的顏色磁學(xué)效應(yīng)尺寸減小到6nm時(shí)，其矯頑力反而降低到零，呈現(xiàn)出超順磁性。熱學(xué)效應(yīng)顆粒小于10納米，其熔點(diǎn)將顯著降低。力學(xué)效應(yīng)呈納米晶粒的金屬要比傳統(tǒng)的粗晶粒金屬硬3～5倍。電子具有粒子性又具有波動(dòng)性，因此存在隧道效應(yīng)。納米顆粒的一些宏觀物理量，如顆粒的磁化強(qiáng)度、量子相干器件中的磁通量等，亦顯示出隧道效應(yīng)，稱(chēng)之為宏觀的量子隧道效應(yīng)。3.2.3宏觀量子隧道效應(yīng)3.3納米技術(shù)的一些作用舉例3.4納米技術(shù)對(duì)于基因疫苗體內(nèi)運(yùn)送的作用納米藥物載體所具備的性質(zhì)可生物降解，毒性較低具有靶向性具有較長(zhǎng)的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間具有刺激相應(yīng)控制釋放性3.4.1脂質(zhì)體應(yīng)用于基因疫苗的運(yùn)送

脂質(zhì)體是指將藥物包封于類(lèi)脂質(zhì)雙分子層內(nèi)而形成的微型泡囊體。用脂質(zhì)體包裹DNA疫苗可通過(guò)非注射方式將DNA疫苗轉(zhuǎn)運(yùn)到動(dòng)物或人體內(nèi)。脂質(zhì)體與其他運(yùn)載體相比具有靶向性和淋巴定向性、緩釋作用、提高主藥穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)。因此，當(dāng)用脂質(zhì)體包裹DNA疫苗運(yùn)輸?shù)襟w內(nèi)時(shí)，可延長(zhǎng)疫苗作用時(shí)間。脂質(zhì)體的給藥途徑主要是靜脈注射、肌內(nèi)和皮下注射、口服給藥、眼部給藥、肺部給藥、經(jīng)皮給藥和鼻腔給藥等。2006年，JérmeV等人應(yīng)用一個(gè)新型脂質(zhì)體(AVE3)轉(zhuǎn)運(yùn)抗原肽到皮膚抗原提呈細(xì)胞(APCs)。在注射點(diǎn)和淋巴結(jié)中，脂質(zhì)體包裹的疫苗產(chǎn)生了長(zhǎng)期表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用脂質(zhì)體包裹的肽抗原能激活體內(nèi)的樹(shù)突狀細(xì)胞，并產(chǎn)生強(qiáng)大的抗腫瘤免疫應(yīng)答。3.4.2納米微針用于DNA疫苗的注射

使用微針進(jìn)行注射不僅能減少疼痛，而且安全度更高，因此它有望成為新一代的注射方法。此外，這種設(shè)備還能用于一些比較危險(xiǎn)的疾?。ㄈ绨滩。┑腄NA注射。Tattoo-美國(guó)科學(xué)家制造的一種微型注射器。納米微針的針尖小于100納米，只穿透對(duì)藥物起屏障作用的角質(zhì)層，使藥物安全經(jīng)皮釋放，結(jié)合了注射和透皮給藥兩方面的優(yōu)勢(shì),是藥物緩控釋領(lǐng)域的重大技術(shù)突破。3.4.3金粒包裹的DNA疫苗用于基因槍給藥基因槍法通過(guò)動(dòng)力系統(tǒng)將帶有基因的金顆粒，將DNA吸附在表面，以一定的速度射進(jìn)靶細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的目的。KimHJ等人證實(shí)基因槍免疫無(wú)論是其介導(dǎo)產(chǎn)生的抗體效價(jià)還是其所需的DNA疫苗劑量，均優(yōu)于肌注途徑。Cui等用殼聚糖或其低聚物與羧甲基纖維素鈉（CMC）制備陽(yáng)離子納米顆粒，將質(zhì)粒DNA包被在這種顆粒表面，用于小鼠皮膚后，免疫效果顯著的高于質(zhì)粒DNA直接涂抹皮膚。而且這種納米粒表面還可進(jìn)行修飾提高體內(nèi)的免疫效果。3.4.4殼聚糖納米粒的應(yīng)用