Westernblot實(shí)驗(yàn)技術(shù)

一、原理

WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。

通過(guò)PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白

質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類(lèi)型及其生物學(xué)活性不變。以固相載為上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與相應(yīng)的抗體

起免疫反映，再與酶、熒光或同位素標(biāo)記的第二抗體起反映，通過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異

性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。

WesternBlot操作美健步！|

1.組織采集或如附焙養(yǎng)

2.樣備

3.SDS

4.轉(zhuǎn)腰

5.一杭的累育

6.二抗的舒育

7.￡B

77

WesternBiol按實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)分重要涉及兩部分：①SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（重要目的為按分子量大

小對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離）；②Western印跡（在韌性支持物上通過(guò)抗原抗體雜交后的顯色強(qiáng)弱反映

蛋白豐度）。

LSDS聚丙烯酰胺凝膠電泳：

該技術(shù)一方面在1967年由ShapirO建立，1969年由webei■和Osbom進(jìn)一步完善。

聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺（簡(jiǎn)稱(chēng)Acr）和交聯(lián)劑N,N'一亞甲基雙丙烯酰胺（簡(jiǎn)稱(chēng)Bis）在催化

劑過(guò)硫酸錢(qián)（AP）,N,N,N'，N'四甲基乙二胺（TEMED）作用下，聚合交聯(lián)向成的具有網(wǎng)狀立體結(jié)

構(gòu)的凝膠，并以此為支持物進(jìn)行電泳。

聚丙烯酰胺凝膠電冰可根據(jù)不同蛋白質(zhì)分子所帶電荷的差異及分子大小的不同所產(chǎn)生的不同

遷移率將蛋白質(zhì)分離成若干條區(qū)帶，假如分離純化的樣品中只具有同一種蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)樣品電

泳后，就應(yīng)只分離出一條區(qū)帶。SDS是一種陰離子表面活性劑能打斷蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵，并按

一定的比例和蛋白質(zhì)分子結(jié)合成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其自身原有的電荷，掩

蓋了各種蛋白分子間天然的電荷差異。因此，各種蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物在電泳時(shí)的遷移率，不再受

原有電荷和分子形狀的影響。這種電泳方法稱(chēng)為SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(簡(jiǎn)稱(chēng)SDS—PAGE)。由

于SDSPAGE可設(shè)法將電泳時(shí)蛋白質(zhì)電荷差異這一因素除去或減小到可以忽略不計(jì)的限度，因此

常用來(lái)鑒定蛋白質(zhì)分離樣品的純化限度，假如被鑒定的蛋m質(zhì)樣品很純，只具有一種具三級(jí)結(jié)構(gòu)

的蛋白質(zhì)或具有相同分子量亞基的具四級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，那么SDS—PAGE后，就只出現(xiàn)一條蛋

白質(zhì)區(qū)帶。

SDS—PAGE具有以下特性：

(1)在一定濃度時(shí)，凝膠透明，有彈性，機(jī)械性能好；

(2)化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反映，在很多溶劑中不溶；

(3)對(duì)pH和溫度變化較穩(wěn)定；

(4)幾乎無(wú)吸附和電滲作用，只要Acr純度高，操作條件一致，則樣品分離反復(fù)性好；

(5)樣品不易擴(kuò)散，且用量少，其靈敏度可達(dá)l()-6g

(6)凝膠孔徑可調(diào)節(jié)，根據(jù)被分離物的分子量選擇合適的濃度，通過(guò)改變單體及交聯(lián)劑

的濃度調(diào)節(jié)凝膠的孔徑；

(7)分辨率高，特別在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體。因而較

醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳等有更高的分辨率。

實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ綀D結(jié)果圖

2.Western印跡:

通過(guò)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳按分子量大小分離后的蛋白質(zhì)，在電場(chǎng)中轉(zhuǎn)移到固相支持物上

（常用硝酸纖維素濾膜）。向后以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與相應(yīng)的抗體起免疫反映,

再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反映，通過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目

的基因表達(dá)的蛋白成分。

轉(zhuǎn)膜模式圖雜交模式圖

二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

一抗體選購(gòu)流程

（1）一方面擬定研究的抗原分子的正式及別用名，明確針對(duì)的種屬，明確除WB以外擬開(kāi)展

的實(shí)驗(yàn)種類(lèi)（如：FlowCyl,ICC/IF,IHC-Wml,IHC-Fr,IHC-P,IP,）。

（2）從常用信譽(yù)較好公司網(wǎng)站查詢(xún)符合（1）中規(guī)定的抗體，國(guó)外公司涉及:Abeam,ABGENT,

cellsignaling,Abnova,chemicon,novus,BD,epitomicso國(guó)內(nèi)推薦:三鷹，中杉金橋,天德悅。仔細(xì)

閱讀抗體說(shuō)明書(shū)，需要考慮因素涉及：是否有文獻(xiàn)已發(fā)表，抗體效價(jià)，到貨周期，抗體價(jià)格，單抗

多抗，包裝規(guī)格，抗體克隆號(hào)，并依據(jù)一抗種屬選擇相應(yīng)的二抗。（注意：一般國(guó)外抗體到貨時(shí)間為

3-5周，國(guó)內(nèi)抗體3-5天）

（3）訂購(gòu)成功后，定期與抗體代理公司聯(lián)系，核算抗體狀態(tài)并督促其及時(shí)到貨。

（4）收到抗體后，第一時(shí)間分裝抗體避免反復(fù)凍融（置于冰上，推薦10ul每支分裝并保存于

-20℃）。妥善保管說(shuō)明書(shū)，建議打印一份放實(shí)驗(yàn)室，原版放辦公室。

（5）每批訂購(gòu)的抗體至少保存5ul存底，用于重要實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

二抗選購(gòu)流程

二抗重要選擇國(guó)內(nèi)抗體，本實(shí)驗(yàn)室選擇天德悅公司產(chǎn)品，使用者重要需考慮種屬問(wèn)題。

樣本制備

（1）樣本制備前需明的確驗(yàn)?zāi)康?，并根?jù)下述實(shí)驗(yàn)方法選擇合適的實(shí)驗(yàn)體系，如：待檢測(cè)蛋

白所處位置（細(xì)胞漿，細(xì)胞膜，分泌蛋白等）

（2）盡量保持細(xì)胞培養(yǎng)的穩(wěn)定性（即實(shí)驗(yàn)的可反復(fù)性），如:細(xì)胞的培養(yǎng)密度，更換培養(yǎng)液時(shí)

間等。

（3）如使用蛋白酶解決，也許會(huì)將目的蛋白降解，同時(shí)還引入了新的蛋白質(zhì)從而干擾實(shí)驗(yàn)。

因此建議解決貼壁細(xì)胞時(shí)，直接在培養(yǎng)瓶中加入裂解液，并用細(xì)胞刮進(jìn)行收集。

（4）蛋白質(zhì)的穩(wěn)定，自從細(xì)胞破裂后，很多蛋白質(zhì)就變得不穩(wěn)定，其中一些蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)

釋放出來(lái)的蛋白酶的作用下被水解，尚有一些在機(jī)械剪切力的作用下發(fā)生斷裂。因此在蛋白質(zhì)提

取過(guò)程中需要輕柔、低溫（全程都在冰浴中進(jìn)行，有條件可使用液氮）、加蛋白本酶克制劑、磷酸

酶克制劑等。

（5）凍存樣本需明確其保存時(shí)間、具體提取信息及保存狀態(tài)。注意蛋白樣本應(yīng)盡量避免反復(fù)

凍融。

（6）常用的蛋白酶克制劑有以下幾種：

絲氨酸蛋臼酶克制劑：PMSF,AEBSF-HC1,Aprotinin,Chymostatin,亮肽素（Lcupcptin）

天冬氨酸蛋白酶:PMSF,碘乙酸、抑肽素（Pepstatin）,云芝發(fā)酵物

疏基蛋白酶克制劑：PMSF,TLCK,TPCK,Anlipain-HC1,N?乙基順丁烯二酰亞胺

金屬蛋白酶克制劑（金屬離子螯合劑）：EDTA,EGTA,塔羅肽

蘇氨酸蛋白酶：目前缺少資料

酸酶克制劑：NaF,激活的原磯酸鈉、焦磷酸鈉、B?甘油磷酸鈉。

（7）提取蛋白濃度信息：

試劑訂購(gòu)

本實(shí)驗(yàn)室WB常規(guī)試劑由黃啟超和張璟組統(tǒng)一訂購(gòu)，訂購(gòu)信息如下:

試劑耗材名稱(chēng)貨號(hào)規(guī)格試劑耗材廠(chǎng)商試劑保訂購(gòu)負(fù)代理聯(lián)系人電話(huà)

存條件責(zé)人公司

黃啟超

PMSF(IOOmM)ST50610ML碧云天-20雅怡李元洲

老師

黃啟超

磷酸酶克制劑S18732g碧云天-20雅怡李元洲

老師

Beia-actin內(nèi)參抗黃啟超

BS-0061RlOOul博奧森-20雅怡李元洲

體老師

Beta-actinmouse黃啟超

TDY041lOOul天德悅（北京：）-20雅怡李元洲

mAb(5B7)老師

Beia-tublinmouse黃啟超

TDY043lOOul天德悅（北京）-20雅怡李元洲

mAb(5G3)老師

Goatanti-Rabbit

黃啟超

IgG(H+L),HRPS-004FlOOul天德悅（北京）-20雅怡李元洲

老師

Conjugated

Goatanti-Mouse

黃啟超

IgG(H+L),HRPS-OO1FlOOul天德悅（北京）-20雅怡李元洲

老師

Conjugated

黃啟超

蛋白彩虹Maker2503/瓶晶彩-20雅怡李元洲

老師

黃啟超

RIPA裂解液（強(qiáng)）P0013B100ml晶彩4℃雅怡李元洲

老師

上樣緩沖液5*還黃啟超

JC-PE0075只/包晶彩-20雅怡李元洲

原型老師

室溫黃啟超

疊氮化鈉BH315-1100g科昊科昊肖建芳

陰涼老師

黃啟超

發(fā)光液JC-PC001500MLMillipore4℃雅怡李元洲

老師

蛋白loading黃啟超

TC-PF0075支/包晶彩-20雅怡李元洲

buffer老師

室溫曲萍老

超厚漉紙

干燥師

曲萍老

牛血清白蛋白DH016-1.125g科昊4℃科昊肖建芳

師

曲萍老

脫脂奶粉DH220-3100gAmresco室溫科昊肖建芳

師

曲萍老

丙烯酰胺DHOO6-3.1500gGenview室溫

師

曲萍老

甲叉雙丙烯酰胺室溫

師

曲萍老

Tris77-86-1500G室溫

師

曲萍老

甘氨酸DH149-1.1500G室溫

師

曲萍老

SDSDH286-1.2500G室溫

師

曲萍老

過(guò)硫酸胺室溫

師

NaCl室溫曲萍老

師

國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)曲萍老

HCL1(X)19318500g室溫

試劑公司師

曲萍老

TEMED4℃

師

9005645/曲萍老

Tween-20生工生物室溫

sj0107b4612j師

曲萍老

甲醇室溫

師

考馬斯亮藍(lán)染色曲萍老

P00I7B250ml碧云天室溫

液師

考馬斯亮藍(lán)染色曲萍老

P0017C500ml碧云天室溫

脫色液師

曲萍老

麗春紅POO22120ml碧云天室溫

師

曲萍老

。-疏基乙醇110112100ml西安國(guó)安生物室溫

師

曲萍老

薄濾紙室溫

師

曲萍老

封口袋室溫

師

曲萍老

配膠玻璃版180-15040.75萊博公司室溫

師

曲萍老

配膠短玻璃版180-1507萊博公司室溫

師

曲萍老

梳子180-180415孔萊博公司室溫

師

曲萍老

電泳電極室溫

師

millipore,

PVDF膜曲萍老

IPVH0001026.5cmX3.75mimmohilon室溫

(0.45uM)師

millipore,

曲萍老

PVDF膜(0.2uM)ISEQ0001026.5cmX3.75mimmohilon室溫

師

曲萍老

冰乙酸室溫

師

曲萍老

Kcl室溫

師

曲萍老

Na2HPO412H2O室溫

師

曲萍老

K2HPO4室溫

師

曲萍老

三氯乙酸室溫

師

曲萍老

冰乙酸室溫

師

三、操作環(huán)節(jié):

試劑配制

L.10%過(guò)硫酸胺(AP)

過(guò)硫酸胺0.1g

超純水1.0ml

溶解后,0.1ml分裝4℃保存，保存時(shí)間為1周。

2..1.5.Tris?HC1(pH8.8.lowe.buffer

Tris18.17g

超純水80ml

濃鹽酸調(diào)pH至8.8,最后用超純水定容至100ml,過(guò)濾，4℃保存

3..1.0.Tris,HC1(pH6.8)uppe.buffer

Tris12.12g

超純水60ml

濃鹽酸調(diào)pH至6.8,最后用超純水定容至100ml,過(guò)濾，4c保存，

4..10%SDS

SDS5g

蒸儲(chǔ)水至50ml

50C水浴下溶解，室溫保存。

如在長(zhǎng)期保存中出現(xiàn)沉淀，水浴溶化后，仍可使用。

5..30%Aci7Bic(29：1.

丙稀酰胺(Acr)29g

甲叉雙丙稀酰胺(Bic)1g

超純水至100m

溶解后，過(guò)濾，4℃避光保存。

以上1-5可自行配制，也可購(gòu)買(mǎi)SDS凝膠電泳試劑盒（博士德AR01380r碧云天P0012）?,

6..5XSDS上樣緩.(碧云天有售)

0.25mol/LTris-HCIpH6.8

0.5mol/L二硫蘇糖醇，

10%SDS

0.5%溪酚藍(lán)

50%甘油

7..電泳液緩沖..5..Runnin.buffer

Tris(MW121.14：'15.1g

自氨酸(MW75.07)72g

SDS5g

蒸飽水至1000ml

4℃保存分離6-200KDa

8..轉(zhuǎn)移緩沖1…Transfe.buffe.

甘氨酸(MW75.07)14.4g

Tris(MW121.14)3.03g

SDS0.2g

甲醇200ml

蒸用水至1000ml

4c保存

...染色.500ml

考馬斯亮蘭0.5g

甲醇200ml

冰醋酸50ml

水250ml

10.脫色.500ml

無(wú)水乙醇125ml

冰乙酸50ml

水325ml

11.PBS緩沖.10.…

NaCI80g

KC12g

Na2HPO412H2O36.151g

(OrNa2HPO414.4g)

K2HPO42.4g

蒸飽水至1000ml調(diào)pH至7.4

1xPBST=1xPBS(1000ml)+吐溫20(1ml)

12.10X麗春紅染.

麗春紅s0.2g

三氯乙酸3g

磺基水楊酸3g

蒸儲(chǔ)水至iOnil

使用時(shí)將其稀釋10倍

13.封閉…5%脫脂.4℃保.（完達(dá)山脫脂奶粉）

脫脂奶粉5g

PBST100ml

14.Strippingbuffer100ml

0-疏基乙醇0.69ml

SDS2g

IMTrisHC1PH6.76.25ml

也可采用30%H2O2,但洗脫能力較Shippingbuffer弱。

15.PIERCE或者M(jìn)illipore(P907I9)的ECL發(fā)光液

分A,B液，用前1:1配制。

操作環(huán)節(jié)

(一)蛋白樣品制備

裂解液：50ml

Tris0.121g

NaCI0.146g

,Stockbuffer,可分裝，一20℃保存。

NaF0.105g

焦磷酸鈉0.112g

蔗糖0.428g

Lysisbuffer

Stockbuffer5(X)ul

DTT(IM)0.5ul

蛋白酶克制劑5ul(sigma,P8340)

若研究磷酸化,加入Na3V04,終濃度ImM.

1mol/LDTT(20ml)

1.稱(chēng)取3.09gDTT,加入到50ml塑料離心管中。

2.加20ml的0.01MNaOAc(pH5.2),溶解后使用0.22um濾器過(guò)濾除菌。

3.分裝后一200c保存。

《參照《分了克隆》-IteP884)

此外，也可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康馁?gòu)買(mǎi)碧云天的RIPA裂解液，再加入蛋白醉克制劑即可。

（1）單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提?。?/p>

1.倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液（或?qū)⑵恐绷⒎胖靡粫?huì)兒使殘余培養(yǎng)液流

到瓶底然后再用移液器將其吸走）。

2.每瓶細(xì)胞加3m14c預(yù)冷的PBS（0.01MpH7.2?7.3）。平放輕輕搖動(dòng)1min洗滌細(xì)胞，然后棄去洗液。

反復(fù)以上操作兩次，共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液。將PBS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰匕

3.按1ml裂解液加10uPMSF（iOOmM）,搖勻置于冰上。（PMSF要搖勻至無(wú)結(jié)晶時(shí)才可與裂解液

混合。）

4.每瓶細(xì)胞加400U含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min,為使細(xì)胞充足裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來(lái)回?fù)u

動(dòng)。

5、裂解完后，用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)（動(dòng)作要快），然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液移

至1.5ml離心管中。（整個(gè)操作盡量在冰上進(jìn)行.）

6.于4℃卜13500rpm離心25min。（提前開(kāi)離心機(jī)預(yù)冷）

7、將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒0.5min的離心管中放于?20℃保存。

（2）組織中總蛋白的提取：

如心肌組織

稱(chēng)量lOOmg一—用預(yù)冷的PBS清洗（300g5min4℃）（若無(wú)血液殘留此步可省略）——加Lysisbuffer

50（）ul一—剪碎一一勻漿Imin低溫（在冰上操作）——離心（12023gIOmin4℃）一一取上清。

分裝-80C凍存，蛋白定量。

取部分樣品加入loadingbuffer5x（可購(gòu)買(mǎi)碧云天的loadingbuffer）,（蛋白：buffer=體積比

4:1）煮沸5分鐘，-20'C保存。

（二）蛋白定量

PIERCE,BCA蛋白定量試劑盒，按說(shuō)明操作。

（三）SDS-PAGE電泳

（1）制膠

凝膠濃度與蛋白分離范圍

(%)此笈?用是圈fKD）

151243

101668

7.53694

5.057212

凝膠配方

5%ll:o30%AB10%APTKMKD

X"210038。305(N)30

5ml340063050830505

12%H2O|0%S|>S30%ABIO%APTEMED

5ml]600130050200050

Kind3300250010040001004

15%H：01.5MTri?PH?.8i<r?sl>s30".AB10%APTEMED

5mlnoo1300SO250050

Ibnil2A00250010050001004

6%IL.Ol.5MTriMpHX.N10*.N|>S30%AB10%APTEMED

5inl26001300so1000504

1加U5500250010020001008

配膠,按順序加，上下層膠一起配，節(jié)省時(shí)間和槍頭，最后加AP和TEMED。

清洗玻璃板：一只手扣緊玻璃板，另一只手蘸點(diǎn)洗衣粉輕輕擦洗。兩面都擦洗過(guò)后用自來(lái)水沖，再用蒸

儲(chǔ)水沖洗干凈后立在筐里晾干。

（2）灌膠與上樣

a、玻璃板對(duì)齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠。（可以用1%瓊脂糖在垂直電泳

槽的左、右和下部封邊，五分鐘后反復(fù)一次，這樣可以保證基本不漏膠）

b、按前面方法配12%分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。灌膠時(shí)，可用10ml槍吸取5ml

膠沿玻璃放出，待膠面升到綠帶中間線(xiàn)高度時(shí)即可。然后膠上加一層水，液封后的膠凝的更

快。（灌膠時(shí)開(kāi)始可快些，膠面快到所需高度時(shí)要放慢速度。操作時(shí)膠定要沿玻璃板流

下，這樣膠中才不會(huì)有氣泡。加水液封時(shí)要慢，否則膠會(huì)被沖變型。）

c、當(dāng)水和膠之間有一條折射線(xiàn)時(shí)，說(shuō)明膠已凝了。再等3min使膠充足凝固就可倒去膠上層水并

用吸水紙將水吸干。（一般下層膠凝固需要40min。）

d、按前面方法配5%的濃縮膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿(mǎn)濃縮膠然后將

梳子插入濃縮膠中。灌膠時(shí)也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時(shí)要使梳子

保持水平。由于膠凝固時(shí)體積會(huì)收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝

固的過(guò)程中要經(jīng)常在兩邊補(bǔ)股（其實(shí)說(shuō)經(jīng)常有點(diǎn)過(guò)了，補(bǔ)1-2次就行了，不補(bǔ)股問(wèn)題也不大）。

待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。（一般上層膠凝固

需要30min。）

e、測(cè)完蛋白含量后，計(jì)算含60-80ug蛋白（根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行選擇，沒(méi)有固定的量）的溶

液體積即為上樣量。取出上樣樣品至2（X）ul的EP管中，加入5XSDS上樣緩沖液至終濃度為1

X。（上樣總體枳一般不超過(guò)1541,加樣孔的最大限度可加20U樣品）（其實(shí)大一點(diǎn)的垂直

電泳槽每孔最大上樣量可以達(dá)成40ul,股做得很好的話(huà)50u也是問(wèn)題不大的）上樣前要將樣

品于沸水中煮5-10min使蛋白變性。

加足夠的電泳液（1*RUNNINGBUFFER）后開(kāi)始準(zhǔn)備上樣。（電泳液至少要漫過(guò)內(nèi)測(cè)的小玻璃板。）用微

量進(jìn)洋器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進(jìn)氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。（加樣太快可

使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也也許使樣品溢出。加入下一個(gè)樣品時(shí)，進(jìn)樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌數(shù)次,

以免交叉污染）

電泳：電泳時(shí)間一般4?5h,電壓為40V較好，也可用60V。（為了加快速度，濃縮膠時(shí)用80V跑，到分離

膠以后用120V跑）電泳至濱酚蘭剛跑出即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜（假如目的條帶比較大的話(huà)，最佳使用

可視的蛋白Preslainmarker,Fermenlas的0441和0671比較好。一般要讓目的條帶跑過(guò)度離狡的1/3比較好,

不要局限于此說(shuō)明）。

清水沖洗膠板，小心取出膠，考染4h/過(guò)夜一一脫色液2h/過(guò)夜。觀測(cè)脫色后膠里的藍(lán)色帶紋，與對(duì)照比較

或?qū)ふ耶惓４值膸Ъy，并比較其分子量，判斷是否是預(yù)期的基因產(chǎn)物。（此步可省略），使用過(guò)的染料

可以反及使用多次。

（四）轉(zhuǎn)膜

NCR后嫻PVDFR

員W?和分解[S[55

i般

[is域高(ft

適合于存

船勘125-200UQ/cm2（SDS

80-110ug/cm2>400ug/on2在片鼬碘合）

材料質(zhì)地砌5厥軟獺實(shí)磯螃度高

解幅受性無(wú)無(wú)有

搟幡觸觸氣泡

[amffi<l浦M使肺100%甲朝箍

就鼬，可用放搬和郭明就染色，比較于NOR,可用料

檢財(cái)式不能用陰離子蝴斯亮黃鼬，可用于檢測(cè)，惻

性檢費(fèi)ECLI

免疫檢胤

OS小分為白、

0.45umHRlfi期性蛋白、■能和

適用就0,2um-好量小于20k游白噓白檢測(cè)和蛋白雕序

胃白多18住要用在

（Hum一分子立小于7kD空白搬械閘

i價(jià)格價(jià)械便直|05|較貴

取出玻璃膠板，用自來(lái)水沖洗干凈，塑料刀輕輕撬開(kāi)上方的玻璃板，沿膠分界線(xiàn)切掉上層膠，切掉多余的膠,

將切好的膠放入預(yù)冷的transferbuffer中浸泡30min。

校股大小切PVDF膜（用尺子量膠的大小，再用鉛筆做標(biāo)記），先用甲醇浸泡5min,再放入transferbuffer

中。按膠大小切兩塊超厚濾紙（濾紙應(yīng)當(dāng)比膜小），放入transferbuffer中浸泡5min以上使用。

（PVDF膜,millipore;超厚濾紙,Bio-Rad）

Bio-Rad半干轉(zhuǎn)系統(tǒng)：電轉(zhuǎn)三明治順序如下

+極

—極

順序?yàn)椋宏帢O一》濾紙一》膠一》膜一》濾紙。濾紙的長(zhǎng)寬分別比膠小1-2mm.而膜的長(zhǎng)寬分別比膠大1—2mm。

絕對(duì)禁忌：上下兩層濾紙由于過(guò)大而互相接觸，這樣會(huì)短路，電流不會(huì)通過(guò)膠和濾紙。

各層間不能有氣泡，特別是膠與膜之間。可用沾濕的玻璃棒輕輕碾開(kāi)，趕走氣泡。與膠相接觸的面為膜的正面,

剪膜的一角作為標(biāo)記。

蓋上蓋子，打開(kāi)電源開(kāi)始轉(zhuǎn)膜。設(shè)立電壓25v,時(shí)間30min。（40-100kd此條件即可）。電流應(yīng)在0.1-0.2之間，不

得大于0.3,若過(guò)大應(yīng)及時(shí)停止，也許是液體不好。

（1）轉(zhuǎn)完后將膜用lx麗春紅染液染5min（于脫色搖床上搖）。然后用水沖洗掉沒(méi)染上的染液就可看到

膜上的蛋白。（一般不需要做這步）

（2）封閉

將膜放在用5%脫脂奶粉中（平皿裝），37。CIh.1

若所測(cè)樣品中具有生物素則不能用脫脂牛奶，改用5%BSA（BSA組分五，鼎國(guó)有售）。

（五）免疫反映（也可使用雜交袋進(jìn)行一抗和二抗的孵育，節(jié)約抗體）

（1）將一抗用PBST稀釋至適當(dāng)濃度（在1.5ml離心管中）；剪下適當(dāng)大小的一塊兒PE手套鋪于上，四角用水

浸濕以使手套保持平整：將抗體溶液加到PE手套I-.；從封閉液中取出膜，用濾紙吸去殘留液后，將膜蛋白面朝

下放于抗體液面上，掀動(dòng)膜四角以趕出殘留氣泡；用保鮮膜蓋住,4度過(guò)夜（或者室溫下孵育1?2h后），用PBST

在室溫下脫色搖床上洗3次，每次5niin。

（2）同上方法準(zhǔn)備二抗稀釋液并與膜接觸，室溫下孵育1?2h后，用PBST在室溫下脫色搖床上洗3次，每次

5min,

（六）化學(xué)發(fā)光，顯影，定影

（1）將PIERCE或者M(jìn)illiporc（P90719）的ECL發(fā)光液，A和B兩種試劑1:1混合,待用。

（2）打開(kāi)凝膠成像系統(tǒng)，打開(kāi)抽屜鋪上保鮮膜，盡量鋪平。放上PVDF膜，關(guān)上抽屜，打開(kāi)光圈，調(diào)整

膜的位置，具體如下：

打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)；

打開(kāi)成像系統(tǒng)及電腦；

鋪上保鮮膜，放上PVDF膜，加上發(fā)光液，關(guān)閉抽屜：

點(diǎn)擊桌面上QuantityOne,從FILE下拉菜單中選擇ChemiDocXRS,打開(kāi)圖像采集窗口，自動(dòng)曝光,

保存,FREEZEo

（七）凝膠圖象分析：用凝膠圖象解決系統(tǒng)分析目的帶的分子量和凈光密度值。

（八）發(fā)光完的PVDF膜仍可反復(fù)使用，sirip掉抗體（strippingbuffer,50度45min；or30%H2O237度15min）,

漂洗三遍后從封閉開(kāi)始做其他抗體。

四、常見(jiàn)問(wèn)題

對(duì)初學(xué)者看什么資料比較好？

《技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南》和Antibodies（alaboratorymanual,wrotebyEdHarlow,davidlane）兩本書(shū)

不錯(cuò)。

兩快玻璃板之間灌膠,膠為什么總是不平？

1;玻璃沒(méi)有洗干凈，應(yīng)當(dāng)要洗得非常干凈。

2；過(guò)硫酸錢(qián)和TEMED的加量不合適，加量相對(duì)較多，凝膠凝固過(guò)快也會(huì)膠不平，最多按照分子克隆加

倍。

3；加完試劑以后沒(méi)有很好的搖勻，導(dǎo)致有此部位的聚合劑濃度過(guò)高，聚合相對(duì)較快導(dǎo)致膠不平。

4；稍微注意手法，均勻加入。

5；灌