2025年上學期高三生物多聚酶鏈式反應擴增DNA片段試題一、選擇題（每題6分，共30分）聚合酶鏈式反應（PCR）是一種體外迅速擴增DNA片段的技術(shù)。PCR過程一般經(jīng)歷下述三十多次循環(huán)：95℃下使模板DNA變性、解鏈→55℃下復性（引物與DNA模板鏈結(jié)合）→72℃下引物鏈延伸（形成新的脫氧核苷酸鏈）。下列有關(guān)PCR過程的敘述中不正確的是A．變性過程中破壞的是DNA分子內(nèi)堿基對之間的氫鍵，也可利用解旋酶實現(xiàn)B．復性過程中引物與DNA模板鏈的結(jié)合是依靠堿基互補配對原則完成C．延伸過程中需要DNA聚合酶、ATP、四種核糖核苷酸D．PCR與細胞內(nèi)DNA復制相比所需要酶的最適溫度較高進行PCR擴增時通常在反應緩沖液中添加Mg2?，其主要作用是A．維持反應體系的滲透壓穩(wěn)定B．激活TaqDNA聚合酶的活性C．促進引物與模板鏈的堿基配對D．抑制DNA酶對模板鏈的降解利用引物P?、P?對某生物基因組DNA進行PCR擴增和電泳分析，下列敘述錯誤的是A．PCR反應中TaqDNA聚合酶是沿著模板鏈的3'端向5'端聚合核苷酸B．電泳時DNA片段由負極向正極泳動，膠板上端為負極C．若用32P標記引物P?，每個DNA分子經(jīng)4輪PCR循環(huán)后，可獲得16條含32P標記的DNA單鏈D．若用32P標記引物P?，每個DNA分子經(jīng)4輪PCR循環(huán)后，可獲得8個含32P標記且長度為b的DNA分子數(shù)字PCR技術(shù)是第三代PCR技術(shù)，通過將樣本稀釋后分配到數(shù)萬份反應單元中獨立擴增，再統(tǒng)計熒光信號陽性的單元數(shù)計算初始模板濃度。與傳統(tǒng)PCR相比，其突出優(yōu)勢是A．降低引物與模板的非特異性結(jié)合B．實現(xiàn)對模板DNA的絕對定量C．縮短反應所需的循環(huán)次數(shù)D．減少TaqDNA聚合酶的用量某研究小組利用PCR技術(shù)擴增目的基因，下列操作會導致擴增產(chǎn)物長度異常的是A．引物設(shè)計時包含目的基因內(nèi)部的重復序列B．反應體系中dNTP濃度過高C．變性溫度從95℃降至90℃D．延伸時間從30秒延長至1分鐘二、非選擇題（共70分）（一）基礎(chǔ)原理填空（每空2分，共20分）PCR技術(shù)的全稱是___________，其核心原理是模擬生物體內(nèi)___________過程，通過___________次循環(huán)實現(xiàn)DNA片段的指數(shù)級擴增（公式為___________）。典型PCR反應體系包含六大組分：、、TaqDNA聚合酶、dNTP混合物、Mg2?緩沖液和無菌水。其中，dNTP的作用是___________和___________。引物設(shè)計需滿足三個關(guān)鍵條件：①與模板鏈的___________端互補配對；②避免自身形成___________結(jié)構(gòu)；③兩條引物之間無互補序列以防引物二聚體形成。（二）實驗分析題（共25分）玉米（2n=20）雌雄同株異花，從某自交系（甲）中選育出2個雄性不育突變體（乙和丙）。已知雄性不育基因E?、E?由可育基因E突變所致。利用引物P?和P?對甲、乙、丙及雜交后代（丁和戊）的基因組DNA進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)SnaBⅠ酶切后電泳，結(jié)果如圖1所示。圖1PCR產(chǎn)物酶切電泳圖譜甲：1000bp（未酶切）、600bp+400bp（酶切后）乙：1000bp（未酶切）、600bp+400bp（酶切后）丙：1200bp（未酶切）、800bp+400bp（酶切后）?。住烈褾?）：1000bp（未酶切）、600bp+400bp（酶切后）戊（甲×丙F?）：1000bp+1200bp（未酶切）、800bp+600bp+400bp（酶切后）回答下列問題：（1）E?基因與E基因相比，由于___________導致編碼的蛋白質(zhì)中1個氨基酸改變；E?基因因編碼區(qū)插入一段DNA序列，導致轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物出現(xiàn)___________，使蛋白質(zhì)氨基酸數(shù)目減少（4分）。（2）甲×乙的F?中可育株285株、不育株94株（接近3:1），說明雄性不育對可育為___________性狀，乙的基因型是___________。甲×丙的F?中可育株139株、不育株45株，推測E?基因的遺傳遵循___________定律（6分）。（3）電泳結(jié)果顯示，丙的PCR產(chǎn)物比甲長200bp，推測E?基因的突變類型是___________。若將戊（E?e）與甲（EE）雜交，F(xiàn)?中可育株與不育株的比例為___________（5分）。（4）為保存雄性不育突變體，需長期保留雜合子。除PCR-酶切法外，還可采用的鑒定方法有___________和___________（列舉2種，6分）。（三）實驗設(shè)計題（共25分）某實驗室欲利用PCR技術(shù)擴增新冠病毒ORF1ab基因（長度1200bp），現(xiàn)有如下材料：病毒cDNA模板、引物（F：5'-ATGTTGCTTGTGGTGCTG-3'，R：5'-TTAGTCCTGCTGCTGCTG-3'）、2×PCRMix（含Taq酶、dNTP、Mg2?）、無菌水。回答下列問題：（1）設(shè)計PCR反應體系（總體積50μL）：需加入cDNA模板2μL、上下游引物各___________μL（濃度10μmol/L，終濃度0.4μmol/L）、2×PCRMix___________μL，其余用無菌水補足（4分）。（2）若反應程序設(shè)置為：95℃預變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s（共35個循環(huán)）；72℃終延伸10min。①退火溫度設(shè)置為55℃的依據(jù)是___________（計算引物Tm值的經(jīng)驗公式：Tm=4×(G+C)+2×(A+T)）（3分）；②延伸時間設(shè)置為60s的理由是___________（已知Taq酶的延伸速率為50-100bp/s）（3分）。（3）擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，出現(xiàn)三條條帶（2000bp、1200bp、800bp）。①最可能的異常原因是___________（3分）；②驗證該假設(shè)的方案是：___________（6分）。（4）若要將擴增產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒載體中，需在引物5'端添加___________序列，以便后續(xù)用___________酶進行定向連接（6分）。（四）拓展應用題（共10分）某考古團隊從唐代墓葬中提取到疑似人類遺骸的DNA片段，欲通過PCR技術(shù)擴增其Y染色體特異性基因。由于古代DNA高度降解，應采用的優(yōu)化措施有：①使用___________引物（填“短”或“長”）；②采用___________聚合酶（填“高保真”或“普通”）；③增加___________循環(huán)次數(shù)（填“前”或“后”）；④反應體系中添加___________以抑制DNA酶活性。三、選做題（任選一題作答，10分）技術(shù)創(chuàng)新方向：簡述巢式PCR（NestedPCR）與常規(guī)PCR的差異，并說明其在臨床檢測（如新冠病毒變異株鑒定）中的應用優(yōu)勢。誤差分析：某學生在PCR實驗中發(fā)現(xiàn)陰性對照（無模板）出現(xiàn)擴增條帶，請列出三種可能原因及對應的解決方案。參考答案及評分標準（部分）選擇題：1.C2.B3.A4.B5.A填空題：6.聚合酶鏈式反應DNA復制302?7.模板DNA引物提供原料能量8.3'發(fā)夾（或莖環(huán)）實驗分析題：9.（1）堿基替換終止密碼子提前出現(xiàn)（2）隱性E?E?基因分離（3）堿基對插入1:1（4）測交實驗分子雜交技術(shù)實驗設(shè)計題：10.（1）225（2）①引物F的Tm值為54℃（4×(5+5)+2×(4+4)=52，接近55℃）②1200bp需12-24s，60s確保完全延伸（3）①引物與模板非特異性結(jié)合②重新設(shè)計引物并降低退火溫度至52℃（4）限制酶識別序列限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接（注：完整答案及詳細解析見配套教師用書）試題設(shè)計說明：覆蓋度：包含原理（30%）、技術(shù)操作（40%）、實際應用（30%）三大模塊，符合《2025年高考生物考試大綱》對