1、第1章 緒論一、概述1、微生物的基本特點：體積小，比表面積大；吸收多，轉(zhuǎn)化快；生長旺，繁殖快；適應強，易變異；分布廣，種類多二、食品微生物檢驗1、概念： 運用微生物的理論與技術，研究外界環(huán)境和食品中的微生物的種類、數(shù)量、性質(zhì)、活動規(guī)律及其對人和動物健康的影響，建立食品微生物學檢驗方法，確定食品衛(wèi)生的微生物學標準的一門應用性學科?！笆称沸l(wèi)生”與 “食品安全”：1986年，世界衛(wèi)生組織在題為食品安全在衛(wèi)生和發(fā)展中的作用的文件中，曾把“食品衛(wèi)生”與“食品安全” 作為同義詞，定義為：“生產(chǎn)、加工、儲存、制作食品過程中確保食品安全可靠，有益于健康并且適合人消費的種種必要條件和措施” 。2、意義（一）有害

2、微生物對人類和生產(chǎn)的影響：1.引起食品變質(zhì)2.引起食物中毒3.導致人體患病(二) 食品微生物檢驗的意義1、是衡量食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標，也是判定被檢食品能否食用的科學依據(jù)。2、可以判斷食品加工環(huán)境及食品衛(wèi)生的情況，為衛(wèi)生管理工作提供科學依據(jù)。3、可以有效地防止或減少食物中毒和人畜共患病的發(fā)生。4、保證產(chǎn)品的質(zhì)量，避免不必要的損失3、研究特點1）研究對象以及研究范圍廣2）涉及學科多3）實用性及應用型強4）采用標準化4、研究范圍1）生產(chǎn)環(huán)境（車間用水、空氣、地面、墻壁等）；2）原輔料（食用的動、植物，添加劑等）；3）食品加工、儲藏、運輸、銷售等環(huán)節(jié)；4）成品食品。5、研究任務1）研究各類食品中微生

3、物種類、分布及其特性；2）研究食品的微生物污染及其控制，提高食品的衛(wèi)生質(zhì)量；3）研究食品中致病性、中毒性、致腐性微生物；4）研究微生物與食品保藏的關系； 5）研究各類食品中微生物的檢驗方法及標準。6、食品微生物檢驗的發(fā)展過程1）致病菌檢測階段2）指示菌檢測階段（1指示菌：在常規(guī)安全衛(wèi)生檢測中，用以指示檢驗樣品衛(wèi)生狀況及安全性的指示性微生物。（2特點：在環(huán)境中存在的數(shù)量多，易于檢出；檢測手段與方法簡單；具有一定的代表性。（3）檢驗目的：以指示菌在檢驗樣品中存在與否以及數(shù)量的多少為依據(jù)，根據(jù)檢出的情況，判斷樣品被污染的程度，間接指示致病微生物有無存在的可能，以及對人群是否構(gòu)成潛在的威脅，對照國家標

4、準，對檢品的食用的安全性作出評價。（4）類型 評價被檢樣品一般衛(wèi)生質(zhì)量、污染程度以及安全性指標：菌落總數(shù)、霉菌、酵母菌等； 特指糞便污染指標：大腸菌群、腸球菌、亞硫酸鹽還原梭菌等； 其他指示菌：包括某些環(huán)境不能檢出的菌類。菌落總數(shù)：指一定數(shù)量或面積的食品樣品，經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)，使每一個活菌只能形成一個肉眼可見的菌落，所得1g或1mL或1cm2檢樣中所含細菌菌落數(shù)量即為菌落總數(shù)，常用CFU（菌落形成單位，clony forming unit）表示。大腸菌群：指一群需氧及兼性厭氧，在37能分解乳糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣的革蘭氏染色陰性無芽孢桿菌。這些細菌均來自人和溫血動物的腸道。3）微生態(tài)制劑檢測階

5、段以乳酸茵、雙歧桿菌為主，以調(diào)節(jié)生態(tài)平衡為目的的各種微生態(tài)制劑，檢驗其菌株的特性和數(shù)量。 4）現(xiàn)代基因工程菌和尚未培養(yǎng)菌的檢測階段5）快速檢測階段化學比色分析法、酶聯(lián)免疫法（ELISA)、免疫膠體金試紙檢測法。生物芯片、傳感器、色譜質(zhì)譜檢測儀。特點： 實驗準備簡化、試劑少；樣品前處理簡單；分析方法簡單、準確、快速。第2章 食品微生物檢驗技術第一節(jié) 培養(yǎng)基 在實驗室中配制的適合微生物生長繁殖或累積代謝產(chǎn)物的任何營養(yǎng)基質(zhì)，都叫做培養(yǎng)基。1、 培養(yǎng)基中的主要成分及其作用（一）營養(yǎng)物質(zhì)：N源、C源、無機鹽、生長因子、水。1、 常用的N源物質(zhì)：蛋白胨、牛肉膏、肉浸汁、酵母膏2、 糖、醇類物質(zhì)單糖：葡萄糖

6、、果糖、半乳糖、甘露糖雙糖：蔗糖、麥芽糖、乳糖多糖：淀粉、纖維素、菊糖 醇類：甘露醇、衛(wèi)茅醇、甘油（二）水 用蒸餾水，不能用自來水。（三）凝固劑瓊脂、明膠、血清等。 要求：清一色、雜質(zhì)少。（4） 抑制劑1、作用：鑒定細菌、抑制雜菌的生長繁殖，增加待檢菌的檢出率。2、種類： 鹽類：氯化鈉、氯化鋰、氰化鉀、亞碲酸鉀（鈉）、亞硒酸鈉等。 染色劑類：煌綠、薔薇酸、結(jié)晶紫、孔雀綠、孟加拉紅、玫瑰紅。 膽鹽類：豬（牛、羊）膽鹽、混合膽鹽、三號膽鹽、去氧膽酸鹽、膽石酸鹽。 抗菌素：青霉素、鏈霉素、桿菌肽、多粘菌素。（5） 指示劑1、作用：用于指示鑒別細菌可否利用分解糖醇類物質(zhì)和含氮化合物，產(chǎn)酸產(chǎn)堿的能力。2

7、、常用的指示劑：酚紅、溴甲酚紫、中性紅、中國藍、甲基紅、復紅、伊紅、美藍、孔雀綠等。二、培養(yǎng)基的類型由于各類微生物對營養(yǎng)的要求不同，培養(yǎng)目的和檢測需要不同，因而培養(yǎng)基的種類很多。我們可根據(jù)某種標準，將種類繁多的培養(yǎng)基劃分為若干類型。（1） 根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)來區(qū)分1、液體培養(yǎng)基 ：主要用于增菌培養(yǎng)、鑒別性培養(yǎng)，大型生產(chǎn)、科研等。2、固體培養(yǎng)基 ：用作微生物的分離、鑒定、檢驗雜菌、計數(shù)、保藏、生物測定等。3、半固體培養(yǎng)基：觀察微生物的動力，菌種鑒定等。4、脫水培養(yǎng)基 ：含有除水分外的一切成分的商品培養(yǎng)基，使用時加水滅菌。（二）根據(jù)培養(yǎng)基的用途來區(qū)分 1、增殖培養(yǎng)基：在普通培養(yǎng)基中加入一些某種微

8、生物特別喜歡的營養(yǎng)物質(zhì)，以增加這種微生物的繁殖速度，逐漸淘汰其它微生物，這種培養(yǎng)基稱為增殖培養(yǎng)基。2、選擇培養(yǎng)基 ：在培養(yǎng)基中加入某種物質(zhì)以殺死或抑制不需要的菌種生長的培養(yǎng)基，稱之為選擇培養(yǎng)基。分離培養(yǎng)用的培養(yǎng)基名 稱 用 途SS瓊脂培養(yǎng)基 沙門氏菌和志賀氏菌屬分離HE瓊脂培養(yǎng)基 志賀氏菌分離鑒別伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基 大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌分離鑒別麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（MacC）腸道致病菌分離甘露醇高鹽瓊脂培養(yǎng)基 綠膿桿菌分離鑒別XLD瓊脂培養(yǎng)基 志賀氏菌、沙門氏菌分離中國藍瓊脂培養(yǎng)基 腸道菌分離鑒別堿性瓊脂培養(yǎng)基 霍亂弧菌分離高鹽蔡氏瓊脂培養(yǎng)基 真菌、酵母菌分離3、鑒別培養(yǎng)基 ：在培養(yǎng)基中加入某種試劑

9、或化學藥品，使難以區(qū)分的微生物經(jīng)培養(yǎng)后呈現(xiàn)出明顯差別，因而有助于快速鑒別某種微生物。這樣的培養(yǎng)基稱之為鑒別培養(yǎng)基。名 稱 用 途蛋白胨水培養(yǎng)基 靛基質(zhì)和霍亂紅試驗乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基 大腸桿菌發(fā)酵乳糖試驗0.5%乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基 腸道菌生化試驗（復發(fā)酵）半固體培養(yǎng)基 動力試驗和菌種保存三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基（TST） 腸桿菌糖發(fā)酵及硫化氫反應氰化鉀基礎培養(yǎng)基 沙門氏菌分離脫羧酶試驗對照培養(yǎng)基 細菌脫羧酶試驗三、培養(yǎng)基制備的基本方法和注意事項 1、培養(yǎng)基的制備記錄 每次制備培養(yǎng)基均應有記錄，包括培養(yǎng)基名稱，配方及其來源，和各種成份的牌號，最終pH值、消毒的溫度和時間，制備的日期和制備者等。2、 培養(yǎng)基成分

10、的稱取 培養(yǎng)基的各種成分必須精確稱取并要注意防止錯亂，最好一次完成，不要中斷?？蓪⑴浞街糜谂詡?cè)，每稱完一種成分即在配方上面做出記號，并將所需稱取的藥品一次取齊，置于左側(cè)，每種稱取完畢后，即移放于右側(cè)。完全稱取完畢后，還應進行一次檢查。3、 培養(yǎng)基各成份的混合和溶化 指示劑應在調(diào)節(jié)好pH值后再加入；煮溶后要補加足水份；不能把培養(yǎng)基煮焦，焦化的不能使用。4、 培養(yǎng)基pH的初步調(diào)正 滅菌后pH值會下降0.10.2，在做培養(yǎng)基校正pH值時，應比實際值高0.10.2；pH調(diào)整后，還應將培養(yǎng)基煮沸。5、 培養(yǎng)基的過濾澄清液體培養(yǎng)基可用濾紙過濾法。瓊脂培養(yǎng)基,可用中間夾有薄層吸水棉的雙層紗布過濾。6、 培養(yǎng)

11、基的分裝斜面： 1/管 半固體培養(yǎng)基：1/3管 高層斜面：1/41/3管 平板：1315mL7、 培養(yǎng)基的滅菌（1）含糖類或明膠的培養(yǎng)基： 113滅菌15分鐘或115滅菌10分鐘。（2）無糖培養(yǎng)基： 121滅菌1520分鐘。（3）血液、體液和抗生素等以無菌操作技術抽取后再加入冷卻至約50左右的培養(yǎng)基中。（4）瓊脂斜面培養(yǎng)基應在滅菌后冷至55-60時取出，再擺置成適當斜面。8、培養(yǎng)基的質(zhì)量測試（）如發(fā)現(xiàn)破裂、水分浸入、色澤異常、棉塞被培養(yǎng)基沾染等,均應挑出棄去。并測定其最終pH。（）將全部培養(yǎng)基放入361C恒溫箱培養(yǎng)過夜， 如發(fā)現(xiàn)有菌生長，即棄去。（）用有關的標準菌株接種12管或瓶培養(yǎng)基，培 養(yǎng)

12、2448小時，如無菌生長或生長不好,應追查原因并重復接種一次，如結(jié)果仍同前，則該批培養(yǎng)基即應棄去，不能使用。9、培養(yǎng)基的保存 （1）基礎培養(yǎng)基不能超過兩周。（2）生化試驗培養(yǎng)基不宜超過一周。（3）選擇性或鑒別性培養(yǎng)最好當天使用，傾注的平板培養(yǎng)基不宜超過3天。培養(yǎng)基配制器材：培養(yǎng)基、玻璃器皿、天平、藥匙培養(yǎng)基配制儀器：滅菌鍋、無菌操作臺培養(yǎng)基配制裝水：以量桶裝取適量蒸餾水于玻璃容器中；于玻璃容器上標示培養(yǎng)基名稱。培養(yǎng)基配制稱藥：放上秤藥紙并歸零；以秤藥匙舀出適當量培養(yǎng)基培養(yǎng)基配制溶解培養(yǎng)基：傾倒培養(yǎng)基時小心不要沾到玻璃壁上注意事項配藥結(jié)束：清理配藥桌面與天平；清洗稱藥匙，擦干放回；藥品放回藥品柜

13、培養(yǎng)基配制分裝：調(diào)整分注器刻度；分裝試管；蓋上試管蓋培養(yǎng)基配制滅菌：放入滅菌鍋滅菌注意事項：拿滅菌后物品記得帶耐熱手套培養(yǎng)基的配制 平板培養(yǎng)基：滅過菌的固態(tài)培養(yǎng)基于無菌操作臺內(nèi)倒制平板培養(yǎng)基第2節(jié) 微生物檢驗的基本操作技術一、無菌技術（一）什么是無菌技術？指在微生物實驗工作中，控制或防止各類微生物的污染及其干擾的一系列操作方法和有關措施。（二）無菌環(huán)境：無菌室、無菌柜、超凈工作臺1、無菌室（1）無菌室的結(jié)構(gòu)：更衣間、緩沖間、操作間。（2）無菌室的消毒和防污染：每日（使用前）紫外線照射（12小時）。每周用甲醛、乳酸、過氧乙酸熏蒸（2小時）。每月用新潔爾滅擦拭地面和墻壁一次。2、超凈工作臺超凈臺的

14、使用與保養(yǎng):（1）風速保持在0.32-0.48米/秒;（2）使用前開啟紫外燈照射30分鐘以上;（3）讓超凈臺預工作1015分鐘;（4）使用完畢后，用70%酒精將臺面和臺內(nèi)四周擦拭干凈。（三）無菌器材滅菌器材：玻璃器皿、培養(yǎng)基、無菌衣等。 消毒器材：無菌室內(nèi)的凳子、試管架、天平、工作臺、手等。（四）無菌操作1、目的：（1）是保證待檢物品不被環(huán)境中微生物的污染；（2）是防止被檢微生物在操作中污染環(huán)境或感染操作人員。2、進入無菌室前的準備（1） 定期檢查無菌環(huán)境的空氣是否符合規(guī)定；（2） 用紫外線滅菌處理3060分鐘；（3） 檢查無菌器材是否完備；（4） 洗手消毒；（5） 手部消毒后，再穿戴無菌工作

15、服。3、檢驗操作過程的無菌操作要求（1） 在操作中不應有大幅度或快速的動作；（2） 使用玻璃器皿應輕取輕放；（3） 在火焰正上方操作；（4） 接種用具在使用前、后都必須灼燒滅菌；（5） 在接種培養(yǎng)物時，動作應輕、準；（6） 不能用嘴直接吸吹吸管；（7） 帶有菌液的吸管、玻片等器材應及時置于盛有5%來蘇爾溶液的消毒桶內(nèi)消毒。 無菌操作取菌技巧 (從斜面取菌）1.接種環(huán)前端鐵絲部分以酒精燈燒紅，后端鐵棒部分過火。2. 試管前端過火。3. 打開試管蓋。4. 試管傾斜，放入接種環(huán)。無菌操作取菌技巧 (從平板取菌）1. 自平板上取單一菌落 (方法一：蓋子微開遮住培養(yǎng)基，避免空氣中菌體掉入；方法二：平板反

16、面拿起)。無菌操作取菌技巧（從液體內(nèi)取菌）1. 調(diào)整移液槍刻度。2. 插上滅過菌的槍頭 (用力插緊)。3. 按鈕壓至第一段 (不可壓至最底)。4. 深入液面下 2 - 4 mm。5. 慢慢釋放按鈕，即可 吸取液體。無菌操作接菌技巧1. 試管前端過火。2. 打開試管蓋。方法一：以接種環(huán)沾菌，放入新的培養(yǎng)基中接菌。方法二：以安全吸球吸取菌液，放入新的培養(yǎng)基中，向下排出菌液。方法三：以移液槍吸取菌液，按鈕壓至最底排出菌液。無菌操作錯誤示范試管直放，空氣中菌體容易掉入。操作時距離火源遠。移液槍倒放，菌液容易流入。注意事項生物性廢棄物：放在正確位置以便滅菌。二、微生物的接種與分離技術（一）接種：將微生物

17、接到適于它生長繁殖的人工培養(yǎng)基上或活的生物體內(nèi)的過程叫做接種。、接種工具和方法接種和分離工具：接種針；接種環(huán)；接種鉤；玻璃涂棒；接種圈；接種鋤；小解剖刀常用的接種方法有以下幾種：1）劃線接種：在固體培養(yǎng)基表面作來回直線的移動。 2）三點接種：把少量微生物接種在平板表面上成等邊三角形的三點，讓他們各自獨立形成菌落。3）穿刺接種：用接種針蘸取少量菌種，沿半固體培養(yǎng)基中心向管底作直線穿刺。4）澆混接種：將待接的微生物先放到培養(yǎng)皿中，然后倒入冷卻好的培養(yǎng)基，迅速輕輕搖勻，待平板凝固后，置于適宜溫度下培養(yǎng)。5）涂布接種：先倒好培養(yǎng)基，讓其凝固后再將菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面做左右涂布，讓菌液均

18、勻分布。6）液體接種：從固體培養(yǎng)基中將菌洗下，倒入液體培養(yǎng)基中，或者從液體培養(yǎng)物中，用移液管將菌液接至液體培養(yǎng)基中，或從液體培養(yǎng)物中將菌液移至固體培養(yǎng)基中。 7）注射接種：用注射的方法將待接的微生物轉(zhuǎn)接至活的生物體內(nèi)。8）活體接種 ：用于培養(yǎng)病毒或其它病原微生物，因為病毒必須接種于活的生物體內(nèi)才能生長繁殖。所用的活體可以是整個動物；也可以是某個離體活組織，例如猴腎等；也可以是發(fā)育的雞胚。(二) 分離純化、傾注平板法首先把微生物懸液通過一系列稀釋，取一定量的稀釋液與熔化好的保持在40-50左右的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基充分混合，然后把這混合液傾注到無菌的培養(yǎng)皿中，待凝固之后，把這平板倒置在恒溫箱中培養(yǎng)。單

19、一細胞經(jīng)多次增殖后形成一個菌落，取單個菌落制成懸液，重復上述步驟數(shù)次，便可得到純培養(yǎng)物。 、 涂布平板法首先把微生物懸液通過適當?shù)南♂?，取一定量的稀釋液放在無菌的已經(jīng)凝固的營養(yǎng)瓊脂平板上，然后用無菌的玻璃涂棒把稀釋液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面上，經(jīng)恒溫培養(yǎng)便可以得到單個菌落。 、平板劃線法最簡單的分離微生物的方法是平板劃線法。用無菌的接種環(huán)取培養(yǎng)物少許在平板上進行劃線。當接種環(huán)在培養(yǎng)基表面上往后移動時，接種環(huán)上的菌液逐漸稀釋，最后在所劃的線上分散著單個細胞，經(jīng)培養(yǎng)，每一個細胞長成一個菌落。三、微生物的培養(yǎng)方法（一）根據(jù)培養(yǎng)時是否需要氧氣分好氧培養(yǎng)；厭氧培養(yǎng)：最重要的一點就是要除去培養(yǎng)基中的氧氣。

20、（二）根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)分固體培養(yǎng)；液體培養(yǎng)第三節(jié) 微生物常規(guī)鑒定技術一、形態(tài)結(jié)構(gòu)主要通過染色，在顯微鏡下對其形狀、大小、排列方式、細胞結(jié)構(gòu)（包括細胞壁、細胞膜、細胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性進行觀察，直觀地了解細菌在形態(tài)結(jié)構(gòu)上特性，根據(jù)不同微生物在形態(tài)結(jié)構(gòu)上的不同達到區(qū)別、鑒定微生物的目的。二、培養(yǎng)特性：1）細菌的培養(yǎng)特性：固體培養(yǎng)基：觀察菌落大小、形態(tài)、顏色、光澤度、透明度、質(zhì)地、隆起形狀、邊緣特征及遷移性。液體培養(yǎng)基：表面生長情況（是否有菌膜、菌環(huán)出現(xiàn)）、渾濁度如何、是否有沉淀出現(xiàn)等。半固體培養(yǎng)基：觀察細菌是否有運動、擴散情況。2）酵母菌的培養(yǎng)特性：固體培養(yǎng)基：大多數(shù)酵母菌沒有絲狀體

21、，在固體培養(yǎng)基上形成的菌落與細菌很相似，只是比細菌菌落大且厚。 液體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基也和細菌相似，有均勻生長、沉淀或在液面形成菌膜。3）霉菌培養(yǎng)特性：霉菌有分支的絲狀體，菌絲粗長，在適宜條件的培養(yǎng)基里菌絲無限伸長，沿培養(yǎng)基表面蔓延。霉菌的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲和孢子絲都常帶有不同的顏色，因而菌落邊緣和中心，正面和背面的顏色常常不同。三、生理特性試驗1、適應環(huán)境特性試驗：各種微生物對生活的環(huán)境均有不同的適應性，對這些環(huán)境因素的適應性實驗是微生物檢驗研究的基本內(nèi)容，也常用來鑒別一些在形態(tài)和其他方面不易區(qū)分的微生物。 （1）生長溫度試驗：各種微生物進行正常的新陳代謝均要有一定的生長溫度范圍，如果環(huán)境溫

22、度超出這個范圍，便會對微生物產(chǎn)生不利影響，引起微生物生長停滯甚至大量死亡。試驗方法：將微生物分別接種于5、10、20、30、37、41、45、55培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1-2d，觀察不同溫度下各個微生物的生長情況，確定生長溫度范圍和最適溫度。同時還要做一個空白試驗，即準備一只未接種的培養(yǎng)基試管在37 下同時培養(yǎng)，若空白試管未見異常，則試驗結(jié)果有效。（2）耐熱試驗：測定生物在不同溫度下的抵抗能力。普通微生物的營養(yǎng)體在60-70可存活30min，在100時幾分鐘即可死亡，而細菌芽孢及真菌孢子等對熱的抵抗力就很強。試驗方法：將純培養(yǎng)物各取0.1mL，接種于一系列肉湯培養(yǎng)基中，分別置于50、53、56、60、6

23、5、70、80、90等不同的高溫水浴中，隔水加熱10min或30min后立即浸入冷水中冷卻，然后一起放入37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，取出后觀察各管中微生物生長情況。以判斷致死最低溫度和致死時間?？瞻祝和L溫度試驗。（3）生長pH實驗：環(huán)境酸堿度對微生物生長發(fā)育有很大的影響，每一種微生物都有各自的生長pH范圍，可劃分為最高、最適、最低生長PH。大多數(shù)細菌和放線菌的最適生長pH在7.2-7.6之間，真菌類則大約在3.0-6.5的范圍內(nèi)生長。試驗方法：按照不同的實驗菌種選擇適宜的液體培養(yǎng)基，用酸或堿調(diào)整培養(yǎng)基的pH（5.4，5.6,5.810.0等），然后將菌種分別接種于上述培養(yǎng)基中于37 培養(yǎng)1-2

24、d，定時觀察各個微生物的生長情況。判斷微生物的最高、最適、最低生長的pH范圍。（4）耐鹽實驗：觀察滲透壓對微生物生長影響。不同微生物對鹽的濃度要求不同，過高的鹽濃度所形成的高滲透壓會對微生物造成不利影響。試驗方法：將普通肉湯培養(yǎng)液調(diào)成不同濃度的鹽溶液（0、1、2、4、6%.10%等）經(jīng)過滅菌后分別接種待試菌種，然后在37培養(yǎng)，觀察微生物生長情況。判斷菌生長的氯化鈉濃度范圍及最適宜鹽濃度。 2、生化試驗：指通過利用生物化學的方法來測定微生物的代謝產(chǎn)物、代謝方式和條件等來鑒別細菌的類別、屬種的試驗。（一）生化試驗的方法1）在培養(yǎng)物中加入某種底物與指示劑，經(jīng)接種、培養(yǎng)后，觀察培養(yǎng)基的pH值變化。2）

25、在培養(yǎng)物中加入試劑，觀察它們同細菌代謝產(chǎn)物所生成的顏色反應。3）根據(jù)酶作用的反應特性，測定酶的存在。4）根據(jù)細菌對理化條件和藥品的敏感性，觀察細菌的生長情況。（二）生化試驗的注意事項1）待檢菌應是新鮮培養(yǎng)物。培養(yǎng)1824h。2）待檢菌應是純種培養(yǎng)物。3）遵守觀察反應的時間。觀察結(jié)果的時間，多為24或48小時。4）應做必要的對照試驗。5）提高陽性檢出率，至少挑取23個待檢的疑似菌落分別進行試驗。（三）生化試驗的范圍從食品質(zhì)檢的角度，主要是試驗各種糖類能否作為碳源和能源被利用，對于氮源主要檢驗其對蛋白質(zhì)、蛋白胨、氨基酸、銨鹽及硝酸鹽的利用能力。（四）生化試驗1）糖醇類代謝試驗 糖酵解試驗（糖醇類發(fā)

26、酵試驗）原理：不同的細菌對各種糖醇的分解能力及所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物各不同，有的能分解多種糖醇，有的只能分解12種糖醇 ，有的分解糖醇能產(chǎn)酸產(chǎn)氣，有的分解糖醇只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，根據(jù)這些特點，可鑒別細菌。試驗方法：用接種針或環(huán)移取純培養(yǎng)物少許，接種于糖發(fā)酵管中，若為半固體培養(yǎng)基，則用接種針作穿刺接種。置361.0 培養(yǎng)13天，每天觀察結(jié)果。檢視培養(yǎng)基顏色有無變化，小倒管中有無氣泡。一般常用的指示劑為：酚紅、溴甲酚紫、溴百里酚藍 （紅變黃）（紫紅變黃）（藍變黃）。結(jié)果觀察和記錄：產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，陽性，以“+”表示產(chǎn)酸產(chǎn)氣，陽性，以“”表示不產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，陰性，以“-”表示 葡萄糖氧化發(fā)酵（O/F）試驗 原理：細菌

27、對葡萄糖的分解，分為氧化型和發(fā)酵型。氧化型細菌在有氧的條件下才能分解葡萄糖，無氧的條件下不能分解葡萄糖；發(fā)酵型細菌在有氧無氧條件下均可分解葡萄糖；不分解葡萄糖的細菌稱為產(chǎn)堿型。根據(jù)糖管的色澤變化可鑒別細菌。試驗方法：取待檢菌，以穿刺法接種于兩管葡萄糖半固體培養(yǎng)基上，在其中一管加入一層（約1cm）滅菌的液體石蠟以隔絕空氣，在37培養(yǎng)24天，每天觀察結(jié)果。結(jié)果觀察與記錄： 封油管 未封油管發(fā)酵型 產(chǎn)酸（黃色） 產(chǎn)酸（黃色）氧化型 不產(chǎn)酸（藍色） 產(chǎn)酸（黃色）產(chǎn)堿型 不產(chǎn)酸（藍色） 不產(chǎn)酸（藍色） 乙酰甲基甲醇試驗（V-P試驗）原理：某些細菌能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸經(jīng)縮合、脫羧生成乙酰甲基甲醇

28、，后者在強堿環(huán)境下，被空氣中的氧氧化為雙乙酰，在-萘酚和肌酸的催化作用下，雙乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱V-P（+）反應。試驗方法奧梅拉法： 將試驗菌接種于磷酸鹽葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，于361 培養(yǎng)48h， 每1mL培養(yǎng)液加奧梅拉OMeara試劑（加有0.3%肌酸或肌酸酐的40%氫氧化鈉水溶液）0.1mL，搖動試管12min，靜置于37恒溫箱4h ，或在4850 水浴放置2h后判定結(jié)果。結(jié)果觀察與記錄：（1）發(fā)酵管出現(xiàn)紅色者，為陽性，記V-P + （2）發(fā)酵管為黃色或銅綠色者，為陰性，記V-P 甲基紅試驗（M.R試驗）原理：細菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸后，由于代謝的途徑不同，有的細菌可使

29、丙酮酸轉(zhuǎn)化生成乳酸、琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，使培養(yǎng)基pH值下降至pH4.5以下，使甲基紅變紅色，為甲基紅試驗陽性 ；有的細菌使丙酮酸脫羧后形成酮、醇類中性產(chǎn)物，培養(yǎng)液pH5.4，甲基紅呈桔黃色，為甲基紅試驗陰性。試驗方法：挑取新鮮的待試培養(yǎng)物少許，接種于磷酸鹽葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，于361 或30 （以30 較好）培養(yǎng)35天，從第48h起，每日取培養(yǎng)液1mL，加入甲基紅指示劑12滴，立即觀察結(jié)果。結(jié)果觀察與記錄：（1）呈鮮紅色或橘紅色為陽性，呈淡紅色為弱陽性，記MR +； （2）呈橘黃色或黃色為陰性， 記MR -， 迄至發(fā)現(xiàn)陰性并培養(yǎng)至第5天仍為陰性，即可判定結(jié)果。2） 氮源代謝試驗

30、靛基質(zhì)（吲哚）試驗原理：某些細菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基質(zhì)（吲哚）。吲哚與對二甲氨基苯甲醛結(jié)合，可形成紅色化合物，即玫瑰吲哚，以此鑒別細菌。試驗方法：將待檢菌小量接種于培養(yǎng)基中，于361 培養(yǎng)2448h時后，沿試管壁緩慢加入歐-波試劑約0.5mL覆蓋液面，兩液接觸處呈現(xiàn)玫瑰紅色者，為陽性反應，無紅色者為陰性反應。結(jié)果觀察與記錄：呈現(xiàn)玫瑰紅色，為陽性反應，記+；無紅色者，為陰性反應，記尿素酶試驗原理：某些細菌能產(chǎn)生尿素酶，將尿素分解產(chǎn)生氨，氨使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，使培養(yǎng)基中的酚酞指示劑呈粉紅色，培養(yǎng)基由黃色變?yōu)榧t色，為陽性。以此鑒別細菌。試驗方法：挑取1824h待試菌培養(yǎng)物大量

31、接種于液體培養(yǎng)基管中，搖勻，于361培養(yǎng)10，60和120min，分別觀察結(jié)果。 或涂布并穿刺接種于瓊脂斜面，不要到達底部，留底部作變色對照。培養(yǎng)2，4和24h分別觀察結(jié)果，如陰性應繼續(xù)培養(yǎng)至4天，作最終判定，變?yōu)榉奂t色為陽性。結(jié)果觀察與記錄：培養(yǎng)基變成粉紅色，為陽性，記 +；培養(yǎng)基顏色不變，為陰性，記氨基酸脫羧酶試驗原理：某些細菌能產(chǎn)生氨基酸脫羧酶, 可使賴氨酸、鳥氨酸產(chǎn)生脫羧作用, 生成胺類物質(zhì)和CO2。胺類物質(zhì)使培養(yǎng)基呈堿性變紫色，為陽性， 如呈黃色為陰性，以此鑒別細菌。試驗方法：取待檢菌，分別接種于含有氨基酸的培養(yǎng)基內(nèi)和不含氨基酸的對照培養(yǎng)基內(nèi)，在361 培養(yǎng)14天，每天觀察結(jié)果。結(jié)果

32、觀察與記錄：培養(yǎng)基變成紅色，為陽性，記+；培養(yǎng)基變成黃色，為陰性，記 硫化氫（H2S）試驗原理：某些細菌可分解培養(yǎng)基中的含硫氨基酸或含硫化合物，產(chǎn)生硫化氫，硫化氫遇鉛鹽或亞鐵鹽可生成黑色沉淀物PbS或FeS，以此鑒別細菌。試驗方法與記錄：挑取待檢菌，用穿刺接種法接種于三糖鐵培養(yǎng)基上，于361培養(yǎng)2448h，觀察結(jié)果。培養(yǎng)基底部呈黑色，為陽性，記+；培養(yǎng)基底部無黑色，為陰性，記-苯丙氨酸脫氨酶試驗原理：苯丙氨酸脫去氨基，形成苯丙酮酸，苯丙酮酸與氯化鐵作用生成綠色化合物。試驗方法：加氯化鐵試劑結(jié)果記錄：生長于苯丙氨酸培養(yǎng)基上的菌苔出現(xiàn)綠色，記為+3） 三糖鐵(TSI)試驗測定細菌對葡萄糖、乳糖、蔗

33、糖的分解、產(chǎn)氣和產(chǎn)硫化氫情況。原理：如果細菌可利用葡萄糖、乳糖和蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣，培養(yǎng)基全部變黃；如果只可以利用葡萄糖，葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜面先變黃，但因量少，生成的少量酸，因接觸空氣而氧化，加之細菌利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì)，生成堿性產(chǎn)物，故使斜面最后為紅色，底部由于是在厭氧狀態(tài)下，酸類不被氧化，仍保持黃色。如果細菌能分解含硫化合物，產(chǎn)生硫化氫，培養(yǎng)基底部變黑。 試驗方法：以接種針挑取待試菌可疑菌落或純培養(yǎng)物，穿刺接種并涂布于三糖鐵斜面，置361培養(yǎng)1824h，觀察結(jié)果。三糖鐵瓊脂成分：蛋白胨、牛肉膏、乳糖、蔗糖、葡萄糖、氯化鈉、硫代硫酸鈉、硫酸亞鐵銨、酚紅、蒸餾水。記錄： 斜面：黃色為陽

34、性，記為+；紅色記為- 底面：黃色為陽性，記為+；紅色記為- 產(chǎn)氣：產(chǎn)氣為陽性，記為+；不產(chǎn)氣記為- 產(chǎn)硫化氫：培養(yǎng)基底部變黑為陽性，記為+；培養(yǎng)基底部不變黑，記為-。4）呼吸酶類試驗（氧化酶試驗、過氧化氫酶試驗、硝酸鹽還原試驗、氰化鉀試驗）5）毒性酶類試驗（溶血試驗、鏈激酶試驗、卵磷脂酶試驗、血漿凝固酶試驗）四、血清學試驗定義：是將抗原和抗體在體外血清環(huán)境中特異性結(jié)合的實驗。常見的類型主要有：凝集反應、沉淀反應、溶解反應、補體反應和中和反應。特點：特異性強、靈敏度高。1、抗原與抗體：（1）抗原：是一種能夠刺激人體或動物機體的免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應答，產(chǎn)生特異性抗體，并在其體內(nèi)或體外與相應的抗體發(fā)

35、生特異性結(jié)合的物質(zhì)?？乖男再|(zhì)：一般為大分子膠體，相對分子量在10萬以上，且分子量越高，其抗原性越強；大多數(shù)天然抗原物質(zhì)都是蛋白質(zhì)，但并非所有蛋白質(zhì)都具有抗原性；抗原都具有高特異性，其特異性與其本身的化學結(jié)構(gòu)有關；異質(zhì)物質(zhì)才具有抗原性，并且自身與抗原物質(zhì)的親緣關系越遠，抗原性就越強。（2）抗體：是抗原刺激機體免疫系統(tǒng)而引起的免疫應答的產(chǎn)物之一，是一類免疫性球蛋白?？贵w的性質(zhì)：抗體是球蛋白，能與相應的抗原結(jié)合；抗體的相對分子量普遍較抗原大，在15萬-100萬之間；不同動物體內(nèi)的球蛋白不同，因此，同一種抗原刺激不同動物所產(chǎn)生的抗體也會不同。2、診斷血清（1）診斷血清：將已知的抗原注射于動物體，使其

36、產(chǎn)生相應的抗體，采出動物的血液，分離出含有大量抗體的血清，稱為診斷血清（或抗血清、免疫血清）。（2）診斷血清類型：抗O血清：用菌體抗原（O抗原）免疫動物后所獲得的血清?？笻血清：用鞭毛抗原（H抗原）免疫動物后所獲得的血清。表面抗原血清：用含有表面抗原的菌體免疫動物后所獲得的血清。單因子血清：只含有一種特異性抗體的血清。復因子血清：含有兩種抗體的血清稱為復因子血清。多價血清：含有兩種以上抗體的血清稱為多價血清。（3）診斷血清的使用與保存：保存：210 冰箱；無菌取用，有效期2年。3、 凝集試驗（1）顆粒性抗原（細菌、紅細胞等）與相應抗體結(jié)合，在電解質(zhì)參與下所形成的肉眼可見的凝集現(xiàn)象，稱為凝集反應

37、。（2）凝集試驗的方法：1）直接凝集法：顆粒性抗原與相應抗體直接結(jié)合 。2）間接凝集法：可溶性抗原（抗體）先吸附在一種與免疫無關的，顆粒狀微球表面，然后與相應的抗體（抗原）作用。 直接凝集試驗：玻片凝集法原理：用已知抗體作為診斷血清，來檢測未知抗原,以鑒定相應的抗原。方法步驟：于潔凈玻片的一端加診斷血清1滴，另一端加生理鹽水1滴作為陰性對照。用接種環(huán)取待檢菌或血細胞的懸液分別涂于診斷血清和生理鹽水中。輕輕轉(zhuǎn)動玻片，使其充分混勻，靜置數(shù)分鐘，觀察結(jié)果。（凝集者為+）第3章 ） 第3章 食品微生物的基本程序1、 食品微生物檢驗的一般一般步驟 菌落總數(shù) 樣品保存 樣品處理 結(jié)果報告 大腸菌群 樣品采

38、集 分離培養(yǎng) 染色鏡檢 選擇參 檢驗前 致病菌 純 生化驗驗 考菌群 的準備 化 血清學試驗 增菌 分離培養(yǎng) 動物試驗2、 檢驗前的準備1、準備好所需的各種儀器。2、按技術要求將各種玻璃儀器進行清洗、烘干、包扎、滅菌，冷卻后送無菌室備用。3、準備好所用的各種試劑，做好普通營養(yǎng)瓊脂或其他選擇培養(yǎng)基。4、做好無菌室或超凈工作臺的滅菌工作，提前1h滅菌3060min。5、工作衣、鞋、帽等滅菌后備用。6、工作人員進入無菌室后，實驗沒有完成之前不得隨便出入無菌室。三、樣品的采集（一）采樣的步驟采樣前調(diào)查現(xiàn)場觀察確定采樣方案采樣 樣品封存 開具采樣證明（二）采樣的原則（要求）1、嚴格遵守樣品采集的操作規(guī)程

39、。2、所采樣品必須具有代表性。3、采樣操作要防止污染，防止變質(zhì)、損壞、丟失。4、在保存和運送過程中保證樣品中微生物的狀態(tài)不發(fā)生變化.5、采樣標簽應完整、清楚。（三）食品微生物檢驗的采樣方案ICMSF（國際食品微生物規(guī)范委員會）取樣方案；美國FDA的取樣方案；世界糧農(nóng)組織（FAO）取樣方案；我國的食品取樣方案。每批貨物的抽樣數(shù)量不得少于5件，對于需要檢驗沙門氏菌的，不少于8件。（四）食品微生物檢驗采樣方法1、液體樣品采樣方法充分混勻后，無菌操作打開包裝，用100mL無菌注射器抽取，注入無菌盛樣容器。2、 半固體樣品采樣方法無菌操作打開包裝，用無菌勺子從幾個部位挖取樣品，放入無菌容器。 3、固體樣

40、品采樣方法（1）大塊整體食品用無菌刀具和鑷子從不同的部位割取，并注意其代表性；（2）小塊大包裝食品應從不同部位的小塊上切取樣品，放入無菌容器。（3）若為檢驗食品的污染情況，可取表層樣品；若為檢驗食品品質(zhì)的情況，應從深部取樣。4、冷凍食品采樣方法大包裝小塊冷凍食品按小塊個體采??；大塊冷凍食品可用無菌刀從不同部位削取或用無菌手鋸從凍塊上鋸取樣品，放入無菌容器。5、 生產(chǎn)工序監(jiān)測采樣1）車間用水：從車間各龍頭采樣；2）車間臺面、用具及加工售貨員手的衛(wèi)生監(jiān)測：用5cm2孔無菌采樣板和5支無菌棉簽擦拭25cm2面積，擦拭后立即用無菌剪刀將棉簽頭剪入無菌容器中。3）車間空氣采樣：將5個直徑90mm的普通瓊

41、脂平板分別置于車間的四角和中部，打開平皿蓋5min，然后蓋蓋送檢。（五）采樣標簽的填寫標簽內(nèi)容主要：編號、樣品名稱、生產(chǎn)單位、生產(chǎn)日期、產(chǎn)品批號、產(chǎn)品數(shù)量、存放條件、采樣時間、采樣人姓名，現(xiàn)場情況等。4、 樣品的送檢要求1、要快速運送：不要超過3小時；2、若路途遙遠，可在15低溫下運送；3、要注意防污染、防散漏、防變質(zhì)；4、要填寫檢驗申請單。五、樣品的處理方法（一）液體樣品的處理1.瓶裝液體樣品的處理 用點燃的酒精棉球灼燒瓶口滅菌，接著用石炭酸或來蘇爾消毒后的紗布蓋好，再用滅菌開瓶器將蓋啟開；含有二氧化碳的樣品可倒入500mL磨口瓶內(nèi)，口勿蓋緊，覆蓋一滅菌紗布，輕輕搖蕩，待氣體全部逸出后，取樣

42、25mL檢驗。2.盒裝或軟塑料包裝樣品的處理將其開口處用75%酒精棉擦拭消毒，用滅菌剪子剪開包裝，覆蓋上滅菌紗布或浸有消毒液的紗布在剪開部分，直接吸取樣品25mL ，或傾入另一滅菌容器中再取樣25mL檢驗。（二）固體樣品的處理1、搗碎均質(zhì)法均質(zhì)就是指物料的料液在擠壓、強沖擊與失壓膨脹的三重作用下使物料細化，從而使物料能更均勻的相互混合.將中樣(100g)剪碎或攪拌混勻，從中取25g放入帶225mL稀釋液的無菌均質(zhì)杯中，800010000r/min均質(zhì)12min即可。2、 剪碎振搖法將中樣剪碎或攪拌混勻，從中取25g檢樣進一步剪碎，放入帶225mL稀釋液和直徑5mm左右玻璃珠的稀釋瓶中，蓋緊瓶蓋

43、，用力快速振搖50次，振幅要大于40cm。3、 研磨法將中樣剪碎或攪拌混勻，從中取25g檢樣放入無菌乳缽中充分研磨后，再放入帶有225mL無菌稀釋液的稀釋瓶中，蓋緊蓋后充分搖勻。4、 整粒振搖法直接稱取25g整粒樣品置于帶有225mL稀釋液和直徑5mm左右玻璃珠的稀釋瓶中，蓋緊瓶蓋，用力快速振搖50次，振幅要大于40cm。5、胃蠕動均質(zhì)法將一定量的樣品和稀釋液放入無菌均質(zhì)袋中，開機（均質(zhì)器）均質(zhì)。（三）冷凍樣品冷凍樣品，先將中樣在04 下解凍，時間不能超過18h，或在45 下解凍，時間不能超過15min。再取檢樣25g做稀釋處理。6、 樣品的檢驗（一）收樣： 1、收到樣品后逐一核對驗收，登記編

44、號； 如2004年收到的50號樣品，編號可寫成：。2、立即將樣品放在冰箱或冰盒中，并積極做好準備工作。（二）檢驗1、選擇檢驗方法：國內(nèi)：國家標準國外：國際標準：如FAO標準、WHO標準； 每個進口國的標準：如美國FDA標準、日本厚生省標準、歐共體標準等。2、檢驗要求（1）按照標準操作規(guī)程進行檢驗操作，邊工作邊做原始記錄。（2）檢測結(jié)束，連同結(jié)果一起交同條線技術人員復核。復核過程中發(fā)現(xiàn)錯誤，復核人應通知檢測人更正，然后重新復核。（3）檢測人和復核人在原始記錄上簽名，并編寫“檢測報告底稿”。（4）所有檢測項目完成后，檢測人員將原始記錄、樣品卡、報告書底稿交科主任作全面校核。3、樣品的保留（1）陰性

45、樣品：在發(fā)出報告可及時處理；（2）陽性樣品：在發(fā)出報告以后3天才能處理樣品；（3）進口食品的陽性樣品：要保留6個月才能處理；（4）微生物檢驗不進行復檢。七、檢驗結(jié)果的報告1、經(jīng)審核后的報告底稿、樣品卡、原始記錄，上交打印正式報告二份 。2、將報告正本交審核人及批準人簽名，并在報告書上蓋上“檢驗專用章”CMA章和中心公章后對外發(fā)文。3、收文科室或收文人要在檢測申請書上收件人一欄內(nèi)簽字，以示收到該報告的正式文本。4、在報告正式文本發(fā)出前，任何有關檢測的數(shù)據(jù)、結(jié)果、原始記錄都不得外傳，否則作為違反保密制度論處。第四章 食品微生物檢驗指標常用的微生物檢驗指標為三項，即細菌總數(shù)（主要是菌落總數(shù)）、大腸菌

46、群最近似數(shù)和致病菌的檢測。第1節(jié) 食品中菌落總數(shù)的測定一、菌落總數(shù)菌落：指細菌在固體培養(yǎng)基上生長繁殖而形成的能被肉眼識別的生長物，它是數(shù)以萬計相同的細菌集合而成。細菌數(shù)量的表示方法：菌落總數(shù)、細菌總數(shù)菌落總數(shù)：指一定數(shù)量或面積的食品樣品，經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)，使每一個活菌只能形成一個肉眼可見的菌落，所得1g或1mL或1cm2檢樣中所含細菌菌落數(shù)量，常用CFU（菌落形成單位，clony forming unit）表示。按照國家標準方法規(guī)定，即在需氧條件下，37培養(yǎng)48h，能在普通營養(yǎng)瓊脂平板細菌菌落上生長的細菌菌落總數(shù)，所以厭氧或微需氧菌、有特殊營養(yǎng)要求的以及非嗜中溫的細菌，由于現(xiàn)有條件不

47、能滿足其生理需求，故難以繁殖生長。因此，菌落總數(shù)并不表示實際中的所有細菌總數(shù)，也不能區(qū)分細菌的種類。細菌總數(shù)：指在一定數(shù)量和面積的食品樣品，經(jīng)過適當?shù)奶幚砗螅陲@微鏡下對細菌進行直接計數(shù)，其中包括各種活菌數(shù)和尚未消失的死菌數(shù)。二、菌落總數(shù)的衛(wèi)生學意義1、判定食品被細菌污染的程度及衛(wèi)生質(zhì)量食品中細菌數(shù)量越多，說明食品被污染的程度越重、越不新鮮、對人體健康威脅越大。在我國的食品衛(wèi)生標準中，針對各類不同的食品分別制定出不允許超過的數(shù)量標準，借以控制食品污染程度。2、預測食品存用的期限長短食品中細菌數(shù)量越少，食品存放的時間就越長。如菌落總數(shù)為105cfu/cm2的牛肉在0時可存放7天，而菌落數(shù)102c

48、fu/cm2時同樣條件下可存放18天。三、菌落總數(shù)測定的方法平板傾注法：平板表面涂布法；平板表面點滴法四、平板傾注法測定菌落總數(shù)1、檢驗步驟(程序)： 檢樣稀釋處理做平板培養(yǎng)菌落計數(shù)報告結(jié)果1）檢樣稀釋與培養(yǎng)以無菌操作，將檢樣25g剪碎后，放于含有225mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液中，充分振搖，制成1：10的均勻稀釋液。固體樣品加入稀釋液后，最好用滅菌的均質(zhì)器以8000-10000r/min的速度處理1min。 用1mL滅菌吸管吸取1：10的稀釋液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液中，振搖，混合均勻，制成1：100的稀釋液。另取1mL滅菌吸管，按上述操作順序做10倍遞增稀

49、釋液，如此每遞增稀釋一次，即換用一支1mL滅菌吸管。根據(jù)食品衛(wèi)生標準要求或?qū)z樣污染情況的估計，選擇2-3個適宜的稀釋度，分別在做10倍遞增稀釋的同時，即以吸取該樣品稀釋度的吸管移1mL稀釋液于滅菌平皿內(nèi)，每個稀釋度作兩個平皿。稀釋液移入平皿后，應及時將涼至46的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基注入平皿12-20mL，并轉(zhuǎn)動平皿使其混合均勻，同時將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入1mL不含樣品的稀釋液中作空白對照。待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，置于（361） 恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)（482）h。培養(yǎng)條件：普通食品：37 ，48h 清涼飲料、調(diào)味品、糕點、酒類： 37 ， 24h 水產(chǎn)品：30 ，48h平板菌落計數(shù)法測定食品中的菌落總數(shù)，

50、一般采用中溫培養(yǎng)，是因為這些食品衛(wèi)生的要求是嚴格防止消化道傳染病原菌和食物中毒病原菌的污染，這些病原菌都屬于嗜溫性菌，因而測定細菌數(shù)時采用中溫培養(yǎng)是比較合理的。2）菌落計數(shù)和報告到達規(guī)定培養(yǎng)時間，應立即計數(shù)。如果不能立即計數(shù)，應將平板放置于04，但不得超過24h。作平板計數(shù)時，可用肉眼觀察，必要時用放大鏡檢查。記下各平板的菌落數(shù)后，求出同稀釋度的各平板的平均菌落數(shù)。計算出原始樣品中每g（mL）中的菌落數(shù)，進行報告。平板菌落的選擇（1）選取菌落數(shù)在30-300之間的平板作為菌落總數(shù)測定的標準。一個稀釋度使用兩個平皿，應選擇兩個平板的平均數(shù)。（2）呈鏈狀生長的菌落之間無任何明顯界限，作為一個菌落計

51、，如存在有幾條不同來源的鏈，則每條鏈均應按一個菌落計算。（3）如片狀菌落不到平板一半，而另一半又分布均勻，則可以半個平板的菌落數(shù)乘2代表全平板的菌落數(shù)。稀釋度的選擇（1）選取菌落數(shù)在30300之間的平板，若有二個稀釋度均在30300之間時，比值小于或等于2取平均數(shù)，比值大于2則報告其中稀釋度較低的平皿菌落數(shù)。（2）如均大于300，則取最高稀釋度的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告。（3）如均小于30，則以最低稀釋度的平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)報告。（4）如菌落數(shù)有的大于300，有的又小于30，不在30300之間，以最接近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告。（5）如所有稀釋度均無菌落生長，則應按小于1乘

52、以最低稀釋倍數(shù)報告。菌落數(shù)的報告1）菌落數(shù)在1100時，按實有數(shù)字報告。2）如大于100時，則報告前面兩位有效數(shù)字，第三位數(shù)按四舍五入計算。為縮短零的個數(shù)，以10的指數(shù)表示。3）固體檢樣以克（g)為單位報告，4）液體檢樣以毫升（mL）為單位報告，5）表面涂擦則以平方厘米（cm2）報告。 2、檢驗注意事項1）對照平板出現(xiàn)幾個菌落時，要追加對照平板；2）吸管進出瓶子或試管時，吸管口不得觸及瓶口、管口的外圍部分；3）進行稀釋時，吸管口不得與稀釋液接觸;4）為防止細菌增值及形成片狀菌落，檢樣從開始稀釋到傾注最后一個平皿所用時間不宜超過20min。5）稀釋倍數(shù)愈高菌落數(shù)愈少，稀釋倍數(shù)愈低菌落數(shù)愈多。如出

53、現(xiàn)逆反現(xiàn)象，不可作為檢樣計數(shù)報告的依據(jù)。第二節(jié) 食品中大腸菌群的檢驗一、大腸菌群的定義與組成 1、大腸菌群的定義指一群需氧及兼性厭氧，在37能分解乳糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣的革蘭氏染色陰性無芽孢桿菌。2、大腸菌群的組成 埃希氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、產(chǎn)氣克雷伯氏菌屬和腸桿菌等。二、大腸菌群的測定意義糞便污染的指示菌：大腸菌群或大腸桿菌。1、以大腸菌群作為糞便污染指示菌原因1）在糞便中數(shù)量極高；2）在外環(huán)境中存活的時間與致病菌大體相同；3）檢測方法簡便容易。2、大腸菌群的測定意義（1）判斷食品是否受到糞便污染。（2）有利于控制腸道傳染病的發(fā)生和流行。（3）有利于控制食品在生產(chǎn)加工、運輸、保存等過程中的衛(wèi)生狀況。三、大腸菌群的生物學特性形態(tài)與染色：革蘭氏染色陰性，無芽孢桿菌。發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣 。培養(yǎng)特性：1、在伊紅美蘭()瓊脂上的典型菌落:呈深紫黑色或中心深紫色，圓形，稍凸起，邊緣整齊，