1、精選,圖位克隆的基本原理和方法,何宗順 2011.12.7,精選,圖位克隆的基本原理,其基本的原理是： 功能基因在基因組中都有相對較穩(wěn)定的基因座，通過找到與目標性狀緊密連鎖的分子標記，在利用分子標記技術對目的基因精細定位的基礎上，由于水稻全基因組序列的發(fā)布，我們可以得到已定位區(qū)段的候選基因，通過對候選基因進行分析，確定目標基因，最后經(jīng)遺傳轉化試驗證實目的基因功能。,精選,圖位克隆的步驟：,Primary mapping,Fine mapping,Candidate gene,Complementation test,Functional analysis,精選,Primary mapping,

2、primary mapping method and Mapping population,精選,作圖群體,將純合突變體與ZS97進行雜交，對雜交的種子進行基因型鑒定，找到雜合型種子（即種子能夠發(fā)生分離），將雜合F1代種子種下去后就能得到F2代群體。,精選,R/R,r/r,R/R,R/r,F2,R/r,r/r,F1,P1 純合突變體,P2 ZS97,精選,primary mapping method,Bulked Segregment Analysis：群組分離分析法。原理是將分離群體(F2、BC1等)中的個體依據(jù)研究的目標性狀(如抗病、感病)分成兩組，每一組取樣8-15份，在每一組群體中將各

3、個體DNA等量（等濃度等體積）混合，形成兩個DNA池(如抗病池和感病池)。同時需要構建兩個親本（ZH11/ZS97）的BSA池。由于分組時僅對目標性狀進行選擇，因此兩個池間理論上就應主要在目標基因區(qū)段存在差異。,精選,ZH11,ZS97,HL15(W),HL15(M),HY1(W),HY1(M),HY2(W),HY2(M),HY3(W),HY3(M),HY5(W),HY5(M),ZH11,ZS97,HL15(W),HL15(M),ZH11,ZS97,HL15(W),HL15(M),將構建的BSA池分別用本室的255對在親本ZH11/ZS97間存在多態(tài)性的SSR標記進行PCR擴增，經(jīng)過跑PAGE

4、膠找到與目標性狀緊密連鎖的標記。,精選,找到緊密連鎖的分子標記之后我們就要進行一個“陽性”檢測：即檢測這個找到的分子標記是不是真正的與目標性狀連鎖。 我們對F2代群體中隨機選取一個200左右的小群體，將找到的分子標記分別擴增這些樣，看表型與基因型是否對應。 同時我們可以用這個小群體進行一個初步的基因定位。,精選,Fine mapping,一. 表型觀察 二. 篩選交換單株 三. 開發(fā)新的分子標記,精選,R/R,r/r,R/R,R/r,F2,R/r,r/r,F1,P1 純合突變體,P2 ZS97,正常表型,突變表型,精選,ZH11：“A” ZS97：“B” 交換有兩種帶型：H和B,精選,單株 1

5、 2 3 4 5 6 7 8 9 10,M1 M2 M3 M4 M5,H A A B H A A A A B,H A A B A A A A A A,A A A A A A A A A A,A H A A A B H H A A,A H H A A B B H B A,基因和表型相對應！,精選,開發(fā)新的標記： 新的SSR標記： InDel/Caps標記：將要開發(fā)標記的日本晴區(qū)段序列與93-11做一個blast，選取插入或者缺失比較大的位點設計引物。 SNPS標記:可以通過測序找到在ZH11/ZS97間存在單堿基差異的位點，或者找謝老師咨詢。,精選,Candidate gene,將最后精細定位區(qū)段在/cgi-bin/gbrowse/rice/ 中輸入定位區(qū)間的物理位置，即可顯示出候選基因。,精選,精選,精細定位,擴大群體，進行精細定位,精選,找到候選基因后可對候選基因進行分析以排除非目標基因，可以通過比較擴增