1、酶 化 學(xué),（一）酶的生物學(xué)意義,一、酶的概念,一、酶的概念,酶是生物細(xì)胞產(chǎn)生的、具有催化能力的生物催化劑,定義：酶是生物體內(nèi)進(jìn)行新陳代謝不可缺少的受多種因素調(diào)節(jié)控制的具有催化能力的生物催化劑,酶具有一般催化劑的特征： 1.只能進(jìn)行熱力學(xué)上允許進(jìn)行的反應(yīng) 2.可以縮短化學(xué)反應(yīng)到達(dá)平衡的時(shí)間，而不改變反應(yīng) 的平衡點(diǎn) 3.通過(guò)降低活化能加快化學(xué)反應(yīng)速度,催化反應(yīng)的活化能,例： 2H2O22H2O+O2,2.反應(yīng)條件溫和：常溫常壓下即可進(jìn)行，生理pH及溫度,酶的催化特點(diǎn)：,1.催化效率高：酶的催化效率比化學(xué)催化劑高1071013倍， 比非催化反應(yīng)高1081020倍,1mol 過(guò)氧化氫酶 5106 m

2、ol H2O2 1mol 離子鐵 610-4 mol H2O2,例：消化一餐簡(jiǎn)單的午餐，大約需要50年，而在消化道中只需要幾小時(shí),反應(yīng)專一性：選擇性地催化一種或一類相同類型的化學(xué) 反應(yīng)，幾乎不產(chǎn)生副反應(yīng) 底物專一性：只能作用于某一類或某一類結(jié)構(gòu)、性質(zhì)相 似的底物,結(jié)構(gòu)專一性： 絕對(duì)專一性：只作用于一個(gè)特定的底物， 如 麥芽糖酶只作用于麥芽糖，而不作用于其他雙糖 脲酶催化尿素水解，而對(duì)尿素的衍生物不起作用,3.專一性強(qiáng)：酶對(duì)反應(yīng)及底物具有嚴(yán)格的選擇性,酶的催化特點(diǎn)：,相對(duì)專一性：作用于一類結(jié)構(gòu)相似的底物 族(基團(tuán))專一性： 對(duì)鏈兩端的基團(tuán)要求不同，對(duì)其中一個(gè)基團(tuán) 要求嚴(yán)格，對(duì)另一個(gè)則要求不嚴(yán)格

3、例如：-D-葡萄糖苷酶不但要求-糖苷鍵，而且要求-糖苷鍵的一端必須 有葡萄糖殘基，即-葡糖苷，但是對(duì)鍵另一端R基團(tuán)要求不嚴(yán)，因 此它可以催化各種-D-葡萄糖苷衍生物中-糖苷鍵的水解 鍵專一性： 對(duì)鍵兩端的基團(tuán)沒(méi)有嚴(yán)格要求 例如：酯酶催化酯鍵的水解，對(duì)底物R-CO-OR中R及R沒(méi)有嚴(yán)格要求， 只是對(duì)于不同的酯類，水解速率有所不同,立體異構(gòu)專一性：當(dāng)?shù)孜锞哂辛Ⅲw異構(gòu)體時(shí)，酶只能作用 于其中的一種,旋光異構(gòu)專一性：選擇性地識(shí)別旋光異構(gòu)底物并催化這類底物的反應(yīng),幾何異構(gòu)專一性：選擇性地催化某種幾何異構(gòu)體底物的反應(yīng),例：,胰蛋白酶只作用于L-氨基酸殘基形成的肽鍵,-葡糖氧化酶僅能將-D-葡萄糖轉(zhuǎn)變成葡糖

4、酸,琥珀酸脫氫酶只能催化琥珀酸脫氫生成延胡索酸，而不能生成順丁烯二酸,例：,酶能區(qū)分從有機(jī)化學(xué)觀點(diǎn)來(lái)看是屬于對(duì)稱分子中兩個(gè)等 同的基團(tuán)，只催化其中的一個(gè)基團(tuán)，而不催化另一個(gè),例：,若甘油激酶不能區(qū)分兩個(gè)CH2OH基團(tuán)，則會(huì)生成 :,和,例如： 在脫氫酶催化下，底物與NAD+之間發(fā)生氫的轉(zhuǎn)移也有嚴(yán) 格的立體異構(gòu)專一性，對(duì)尼克酰胺環(huán)中的C4上的氫具有 選擇性，如酵母醇脫氫酶在催化時(shí)，輔酶的尼克酰胺環(huán) C4上只有一側(cè)可以加氫或脫氫，另一側(cè)則不被作用,4.可調(diào)性：如酶濃度的調(diào)節(jié)、激素調(diào)節(jié)、反饋調(diào)節(jié)、抑制 劑和激活劑的調(diào)節(jié)、別構(gòu)調(diào)節(jié)、酶的共價(jià)修飾 調(diào)節(jié)、酶原活化等 5. 酶易失活：強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高溫、多種

5、抑制劑,酶的催化特點(diǎn)：,關(guān)于酶作用專一性的幾種假說(shuō),1、鎖鑰學(xué)說(shuō)（Lock and Key theory）, 1894年由 Fischer 提出，將酶與底物的關(guān)系比喻為鎖和鑰匙的 關(guān)系，以此說(shuō)明酶與底物在結(jié)構(gòu)上的互補(bǔ)性 其局限性是不能解釋酶的逆反應(yīng)，如果酶的活性中心是“鎖”， 那么這種結(jié)構(gòu)不可能既適合可逆反應(yīng)的底物，又適合可逆反應(yīng) 的產(chǎn)物,2、誘導(dǎo)契合學(xué)說(shuō)（induced-fit theory）, 1958年由 Koshland提出，認(rèn)為酶分子與底物分子接近時(shí)，酶 蛋白受底物分子誘導(dǎo)，其構(gòu)象發(fā)生有利于底物結(jié)合的變化， 酶與底物在此基礎(chǔ)上互補(bǔ)契合進(jìn)行反應(yīng) 近年來(lái)X射線晶體結(jié)構(gòu)分析的實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持這

6、一假說(shuō)，證明了 酶與底物結(jié)合時(shí)，確有顯著的構(gòu)象變化,二、酶的化學(xué)本質(zhì),大多數(shù)酶是蛋白質(zhì) 1926年美國(guó)Sumner得到脲酶的結(jié)晶，并指出酶是蛋白質(zhì) 1930年Northrop等得到了胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳 蛋白酶的結(jié)晶，并進(jìn)一步證明了酶是蛋白質(zhì),J.B.Sumner,J.H.Northrop,20世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)某些RNA有催化活性，還有一些抗體也有催化活性，甚至有些DNA也有催化活性，使酶是蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)概念受到很大沖擊,某些RNA有催化活性 1982年美國(guó)T. Cech等人發(fā)現(xiàn)四膜蟲(chóng)的rRNA前體能在完全 沒(méi)有蛋白質(zhì)的情況下進(jìn)行自我加工，發(fā)現(xiàn)RNA有催化活性,Thomas Cech Un

7、iversity of Colorado at Boulder, USA,1983年美國(guó)S.Altman等研究RNaseP（由20%蛋白質(zhì)和80%的RNA組成），發(fā)現(xiàn)RNaseP中的RNA可催化E. coli tRNA的前體加工。,Sidney Altman Yale University New Haven, CT, USA,Cech和Altman各自獨(dú)立地發(fā)現(xiàn)了RNA的催化活性，并命名這一類酶為ribozyme(核酶)，2人共同獲1989年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng),1Cell, 1982, 31, 147157,2Sci. Amer. 1986, 255, 6475,酶的化學(xué)組成,酶,單純酶,結(jié)合酶:

8、 (全酶) = 酶蛋白 + 輔助因子,輔助因子,輔酶：與酶蛋白結(jié)合得比較松的小分子有機(jī)物,輔基：與酶蛋白結(jié)合得緊密的小分子有機(jī)物,金屬激活劑：金屬離子作為輔助因子,酶的催化專一性主要決定于酶蛋白部分，輔因子通常是作為電子、原子或某些化學(xué)基團(tuán)的載體,（Holoenzyme）(Apoenzyme),根據(jù)酶分子組成分類：, 單體酶（monomeric enzyme) 僅有一條具有活性部位的多肽鏈，全部參與水解反應(yīng) 寡聚酶 (oligomeric enzyme) 由幾個(gè)或多個(gè)亞基組成，亞基牢固地聯(lián)在一起，單個(gè) 亞基沒(méi)有催化活性，亞基之間以非共價(jià)鍵結(jié)合 多酶復(fù)合物 (multienzyme system

9、) 幾個(gè)酶鑲嵌而成的復(fù)合物，這些酶催化將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的一系列順序反應(yīng),酶的化學(xué)組成,根據(jù)酶蛋白性質(zhì)分類：,三、酶的分類與命名,習(xí)慣命名法 以酶的底物和反應(yīng)類型命名，有時(shí)還加上酶的來(lái)源。習(xí)慣命名簡(jiǎn)單、常用，但缺乏系統(tǒng)性，不準(zhǔn)確(一酶多名、多酶一名、寫(xiě)出反應(yīng)難等),底物+酶：淀粉酶、 脂肪酶、 蛋白酶 來(lái)源+底物+酶：胃蛋白酶、 唾液淀粉酶、胰脂肪酶 反應(yīng)性質(zhì)+酶：水解酶、轉(zhuǎn)移酶、氧化酶 底物+反應(yīng)性質(zhì)+酶：琥珀酸脫氫酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶,習(xí)慣命名,系統(tǒng)命名法 1961年國(guó)際酶學(xué)會(huì)議提出了酶的系統(tǒng)命名法。規(guī)定應(yīng)標(biāo)明酶的底物及反應(yīng)類型，兩個(gè)底物間用冒號(hào)隔開(kāi)，如果一個(gè)底物是水時(shí)，水可省略,例：丙氨酸+-酮

10、戊二酸 谷氨酸+丙酮酸 丙氨酸:-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶,脂肪+H2O 脂酸+甘油 脂肪水解酶,三、酶的分類與命名,1961年國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)（Enzyme Committee, EC）根據(jù)酶所催化的反應(yīng)類型和機(jī)理，把酶分成6大類,在這六大類里，又各自分為若干亞類，亞類下又分小組 亞類的劃分標(biāo)準(zhǔn)： 氧化還原酶 是電子供體類型 轉(zhuǎn)移酶 是被轉(zhuǎn)移基團(tuán)的形狀 水解酶 是被水解的鍵的類型 裂合酶 是被裂解的鍵的類型 異構(gòu)酶 是異構(gòu)作用的類型 合成酶 是生成的鍵的類型,三、酶的分類與命名,酶的系統(tǒng)分類法及編號(hào),用4個(gè)阿拉伯?dāng)?shù)字的編號(hào)表示，數(shù)字中用“”隔開(kāi)，前面冠以EC（為Enzyme Commission）

11、EC 類. 亞類. 亞亞類. 排號(hào) 例如：EC l.1.1.1(乙醇脫氫酶) 表示這個(gè)酶是氧化還原酶，電子供體是醇，電子受體是NAD+, 序列號(hào)是1 EC3.4.4.4(胰蛋白酶)，表示它的類型是水解酶, 水解的鍵是肽鍵, 是內(nèi)切酶而不是外切酶, 序列號(hào)是4,酶的分類,1.氧化還原酶類：主要是催化氫的轉(zhuǎn)移或電子傳遞的氧化 (Oxidoreductase) 還原反應(yīng)，包括脫氫酶類、氧化酶類、 過(guò)氧化氫酶、過(guò)氧化物酶等,AH2 + B（O2）,A + BH2（H2O2，H2O）,（1）脫氫酶類：催化直接從底物上脫氫的反應(yīng),AH2 +B,A +BH2（需輔酶或輔酶）,例：乳酸脫氫酶（EC 1.1.1

12、.27，L-乳酸：NAD+氧化還原酶）,（2）氧化酶類,催化底物脫氫，氧化生成H2O2：,AH2 + O2,A + H2O2（需FAD或FMN）,催化底物脫氫，氧化生成H2O：,2AH2 + O2,2A + 2H2O,例：鄰苯二酚氧化酶（EC 1.10.3.1，鄰苯二酚：氧氧化酶）,鄰苯二酚,鄰苯醌,（3）過(guò)氧化物酶,ROO + H2O2,RO + H2O + O2,（4）加氧酶（雙加氧酶和單加氧酶）,（順，順-已二烯二酸）,轉(zhuǎn)移酶類(Transferase)： 催化化合物中某些基團(tuán)的轉(zhuǎn)移，即將一個(gè)底物分子的基團(tuán)或原子轉(zhuǎn)移到另一個(gè)底物的分子上,AX + B,A +BX,根據(jù)X分成8個(gè)亞類：轉(zhuǎn)移

13、碳基、酮基或醛基、?；?、糖基、烴基、含氮基、含磷基和含硫基的酶,例：谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）（EC 2.6.1.2，L-丙氨酸：-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶）,水解酶類(Hydrolase)： 催化加水分解作用，主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等,AB + H2O,AOH + BH,裂合酶類(Lyase)： 催化非水解性地除去基團(tuán)而形成雙鍵的反應(yīng)或逆反應(yīng),CC鍵,+ CO2,+ H2O,CO鍵,CN鍵,+ NH3,例1：,例2：L-組氨酸裂合酶催化非氧化性、非水解性的脫氨反應(yīng),異構(gòu)酶(Isomerase)： 催化各種同分異構(gòu)體的相互轉(zhuǎn)化，即底物分子內(nèi)基團(tuán)或原子的重排過(guò)程,常見(jiàn)的有消旋和變旋、醛酮異構(gòu)、

14、順?lè)串悩?gòu)和變位酶類,例：,合成酶類(Synthetase) or 連接酶(Ligase)： 能夠催化C-C、C-O、C-N 以及C-S 鍵的形成反應(yīng)，這類反應(yīng)必須與ATP分解反應(yīng)相互偶聯(lián),例：,丙酮酸羧化酶：丙酮酸 + CO2 草酰乙酸,(7) 核酸酶（催化核酸） Ribozyme 核酸酶是唯一的非蛋白酶,它是一類特殊的RNA，能夠催化RNA分子中的磷酸酯鍵的水解及其逆反應(yīng),四、酶的分離和純化,酶的分離純化 由于酶是蛋白質(zhì)，因此有關(guān)蛋白質(zhì)分離、純化和鑒定的方法基本適用于酶，區(qū)別之處在于： 1. 酶分離純化的最終的目的： 提高酶的比活力， 得到更多的酶活力（總活力） 2. 酶的鑒定主要采用特定的

15、酶所催化的化學(xué)反應(yīng)來(lái)鑒定,酶的分離純化 酶的分離、純化需要注意的幾點(diǎn)是： 盡可能在低溫操作(04) 在分離提純過(guò)程中，不能劇烈攪拌 提純?nèi)軇┲屑右恍┍Ｗo(hù)劑，如少量EDTA、-巰基乙醇 在分離提純過(guò)程中要不斷測(cè)定酶活力和蛋白質(zhì)濃度， 從而求得比活力，還要計(jì)算總活力,四、酶的分離和純化,酶的分離和純化,酶分離純化中的幾個(gè)概念 酶活力： 指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力，用酶促反應(yīng)速 度來(lái)表示 酶促反應(yīng)速度：以單位時(shí)間底物濃度的減少或產(chǎn)物濃度 的增加來(lái)表示 酶活性單位：在特定條件下，1分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化1微摩爾底物 所需的酶量為一個(gè)活力單位(Unit)，溫度 規(guī)定為25，其他條件取反應(yīng)的最適條件,比活力： 每毫克

16、蛋白所具有的活力數(shù)，酶的比活越高， 酶的純度越好 比活力(U/mg) = 總活力/酶總量 回收率：每一純化步驟后所得到的酶總活力與第一步總 活力之比 總活力單位體積的酶活力(U/mL)總體積(mL) 純化倍數(shù)：每一純化步驟后的比活力與第一步比活力的 比值,酶的分離和純化,酶活性測(cè)定方法 終點(diǎn)法(End-point method) 又稱化學(xué)反應(yīng)法，是使酶促反應(yīng)進(jìn)行到一定時(shí)間后，終止反應(yīng)，再用化學(xué)或物理方法測(cè)定產(chǎn)物或底物濃度變化的量。優(yōu)點(diǎn)是不受酶的限制、通用性好。缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)長(zhǎng)、工作量大、不能觀察反應(yīng)全過(guò)程 動(dòng)力學(xué)法(Kinetic method) 是連續(xù)測(cè)定酶反應(yīng)過(guò)程中底物產(chǎn)物或輔酶的變化量，可以

17、直接測(cè)出酶促反應(yīng)的初速度。優(yōu)點(diǎn)是迅速、簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、可方便測(cè)得反應(yīng)進(jìn)行的過(guò)程，特別適合反應(yīng)速度較快的酶反應(yīng),（1）分光光度法（spectrophotometry）,該法要求酶的底物和產(chǎn)物在紫外或可見(jiàn)光部分光吸收不同 優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、迅速、準(zhǔn)確， 一個(gè)樣品可多次測(cè)定，有利于動(dòng)力學(xué)研究 可檢測(cè)到10-9mol/L水平的變化,乳酸脫氫酶的活力可用丙酮酸的增加量表示，也可用340nm光吸收的增加量來(lái)表示,例: 人血清乳酸脫氫酶活力的測(cè)定,（2）熒光法（fluorometry）,該法要求酶反應(yīng)的底物或產(chǎn)物有熒光變化,優(yōu)點(diǎn)：靈敏度很高，可以檢測(cè)10-12 mol/L的樣品,酶蛋白分子中的Tyr、Trp、Phe殘基以及一些輔酶、輔基，如NADH NADPH、FMN、FAD等都能發(fā)出熒光,酶活性測(cè)定方法 酶偶聯(lián)法(enzyme coupled method) 在某些酶反應(yīng)中如果底物產(chǎn)物不方便檢測(cè)時(shí)可選擇另一種酶與之發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，即第一種酶催化的產(chǎn)物作為第二個(gè)酶的底物，通過(guò)檢測(cè)第二個(gè)酶促反應(yīng)產(chǎn)物的變化量來(lái)反映第一個(gè)酶的活力，適合活力不高或者產(chǎn)物不容易檢測(cè)的反應(yīng),例：測(cè)