1、基因工程藥物 -干擾素的制備,1,PPT學(xué)習(xí)交流,1 什么是干擾素,概念(interferon,IFN)：機(jī)體免疫細(xì)胞產(chǎn)生的一類細(xì)胞因子，是機(jī)體受到病毒感染時(shí)，免疫細(xì)胞通過抗病毒應(yīng)答反應(yīng)而產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)類似、功能接近的生物調(diào)節(jié)蛋白。 根據(jù)分子結(jié)構(gòu)和抗原性的差異分為、等4個(gè)類型。,2,PPT學(xué)習(xí)交流,1.1天然干擾素的分類,1. 根據(jù)來源、基因序列和氨基酸組成分類 I 型干擾素：IFN、IFN、IFN 、IFN 來源：白細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、病毒感染的組織細(xì)胞等 功能 ：抗病毒感染、抗腫瘤生長 、免疫調(diào)節(jié)(較弱） 其中IFN-為多基因產(chǎn)物，有23種以上的亞型。 II 型干擾素：干擾素（IFN) 來源

2、：活化的T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生 功能：免疫調(diào)節(jié),3,PPT學(xué)習(xí)交流,提高單核巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞的抗原提呈能力 增強(qiáng)Tc細(xì)胞和NK細(xì)胞的殺傷活性 抑制TH2細(xì)胞形成，下調(diào)體液免疫應(yīng)答 趨化作用 抗病毒和抗腫瘤作用（次要） 2. 根據(jù)動(dòng)物來源確定分類 人干擾素（HuIFN），小鼠干擾素（MuIFN）。,4,PPT學(xué)習(xí)交流,不同來源的干擾素,5,PPT學(xué)習(xí)交流,1.2 重組干擾素的臨床應(yīng)用,廣譜抗病毒活性（rhuIFN） 慢性乙型、丙型、丁型肝炎；皰疹、病毒性角膜炎。 直接抗腫瘤活性（rhuIFN） 毛細(xì)胞和慢性髓樣白血病、 Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。 免疫調(diào)節(jié)活性治療慢性肉芽腫瘤（rhuI

3、FN） 多發(fā)性硬化癥 rhuIFN,6,PPT學(xué)習(xí)交流,2 基因工程大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝,7,PPT學(xué)習(xí)交流,干擾素生產(chǎn)工藝路線,上市產(chǎn)品：重組人干擾素rhuIFN 1986，rhuIFN-2a， rhuIFN-2b； 1990，rhuIFN-1b；1993，rhuIFN-1b； 20012002： PEG化IFN，PEG-Intron, Pegasys 表達(dá)產(chǎn)物：無糖基化，N-met，無活性包涵體 工藝特點(diǎn)：發(fā)酵過程，隨后變性、復(fù)性過程。,基因工程大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝:,8,PPT學(xué)習(xí)交流,目的基因的分離,克隆載體,目的基因與克隆載體的體外重組,重組體導(dǎo)入大腸桿菌K12,受體菌的培養(yǎng)及篩選,

4、從受體菌中獲取目的基因,表達(dá)載體,重組質(zhì)粒,導(dǎo)入大腸桿菌,受體菌的篩選，表達(dá)性、穩(wěn)定性等檢測,工程菌,基因工程菌的制備,9,PPT學(xué)習(xí)交流,一、目的基因的分離與擴(kuò)增,1. 破碎細(xì)胞，用Trizol法提取總的RNA 2. 將生產(chǎn)干擾素的人白細(xì)胞的mRNA分級(jí)分離然后進(jìn)行凝膠電泳切取目的基因片段 3. 用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄，把總mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 4. 以cDNA為模板、干擾素引物為引物，PCR，得到完全的干擾素基因的PCR產(chǎn)物 5.人工加尾形成“粘性末端”,10,PPT學(xué)習(xí)交流,二、構(gòu)建重組質(zhì)粒,1. 提取載體（質(zhì)粒、病毒等），雙酶切，再把干擾素基因的PCR產(chǎn)物用相應(yīng)的酶酶切，用連接酶連接

5、,EcoR I,BamH I,EcoR I,BamH I,2.連接完成后分離純化，測序，與原干擾素序列比對(duì)。 3.鑒定序列無誤后，導(dǎo)入受體細(xì)胞，篩選,11,PPT學(xué)習(xí)交流,三、重組體引入宿主細(xì)胞,將cDNA克隆到含有四環(huán)素、氨芐青霉素抗性基因的質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，重組的載體 DNA 分子在一定條件下轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，形成攜帶質(zhì)粒的菌株。,12,PPT學(xué)習(xí)交流,四、受體菌的篩選,由于質(zhì)粒重組時(shí)有3種基本方式，即：目的基因與克隆載體重組，目的基因片段與目的基因片段重組，克隆載體與克隆載體重組；另外重組過程可能會(huì)發(fā)生基因突變情況,13,PPT學(xué)習(xí)交流,五、分析保存,對(duì)基因工程大腸桿菌進(jìn)行評(píng)價(jià)分析，

6、并保存菌種。,14,PPT學(xué)習(xí)交流,干擾素的發(fā)酵工藝過程,啟開種子 制備種子液 發(fā)酵培養(yǎng) 粗提 精提 半成品制備 半成品檢定 分裝 凍干 成品檢定 成品包裝,15,PPT學(xué)習(xí)交流,1菌種培養(yǎng) 取70下保存的甘油管菌種（工作種子批），于室溫下融化。然后，接入搖瓶，培養(yǎng)溫度30，pH7.0，250 r/min活化培養(yǎng)182小時(shí)后，進(jìn)行吸光值測定和發(fā)酵液雜菌檢查。 2種子罐培養(yǎng) 將已活化的菌種接入裝有30L培養(yǎng)基的種子罐中，接種量10%，培養(yǎng)溫度30，pH7.0，級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速，控制溶解氧為30%，培養(yǎng)34小時(shí)，轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐中，同時(shí)取樣發(fā)酵液進(jìn)行顯微鏡檢查和LB培養(yǎng)基劃線檢查，控制雜菌,16

7、,PPT學(xué)習(xí)交流,3.發(fā)酵罐培養(yǎng) 將種子液通入300L培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，接種量10%，培養(yǎng)溫度30，pH7.0。級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速，控制溶解氧30%，培養(yǎng)4小時(shí)。然后控制培養(yǎng)溫度20，pH6.0，溶解氧60%，繼續(xù)培養(yǎng)56.5小時(shí)。同時(shí)進(jìn)行發(fā)酵液雜菌檢查，當(dāng)OD值達(dá)9.01.0后，用5冷卻水快速降溫至15以下，以減緩細(xì)胞衰老?；蛘邔l(fā)酵液轉(zhuǎn)入收集罐中，加入冰塊使溫度迅速降至10以下。 4. 菌體收集 將已降溫的發(fā)酵液轉(zhuǎn)入連續(xù)流離心機(jī)，16000 r/min離心收集。進(jìn)行干擾素含量、菌體蛋白含量、菌體干燥失重、質(zhì)粒結(jié)構(gòu)一致性、質(zhì)粒穩(wěn)定性等項(xiàng)目的檢測。菌體于20冰柜中保存時(shí)，不得超過12個(gè)月

8、。每保存3個(gè)月，檢查一次活性。,17,PPT學(xué)習(xí)交流,3. 干擾素的分離純化工藝過程,3.1、干擾素分離工藝過程 3.2、干擾素的純化工藝過程,18,PPT學(xué)習(xí)交流,3.1 干擾素分離工藝過程,菌體裂解 預(yù)處理 初級(jí)分離,19,PPT學(xué)習(xí)交流,(1)菌體裂解,裂解緩沖液：純化水配制，210（pH7.5） 使用保護(hù)劑：EDTA，PMSF。 破碎菌體：2厘米以下的碎塊 攪拌：加裂解緩沖液，210，2hr 凍融: 細(xì)胞完全破裂，釋放干擾素。,20,PPT學(xué)習(xí)交流,(2)預(yù)處理-沉淀,加絮凝劑聚乙烯亞胺: 210，攪拌45min，對(duì)菌體碎片進(jìn)行絮凝。 加凝聚劑醋酸鈣溶液: 210,攪拌15min，對(duì)菌

9、體碎片、DNA等進(jìn)行沉淀。,21,PPT學(xué)習(xí)交流,(3)離心,連續(xù)流離心機(jī)：210，16000 r/min 收集上清液：含有重組干擾素蛋白質(zhì) 雜質(zhì)沉淀：121、30min 蒸汽滅菌,焚燒處理。,22,PPT學(xué)習(xí)交流,（4）初級(jí)分離,鹽析: 硫酸銨，210，攪勻,靜置過夜。 離心：連續(xù)流離心機(jī)，16000 r/min 保存：收集沉淀，粗干擾素，4保存。,23,PPT學(xué)習(xí)交流,3. 2、干擾素純化工藝過程,溶解粗干擾素 沉淀與疏水層析 陰離子交換層析與濃縮 陽離子交換層析與濃縮 凝膠過濾層析 無菌過濾分裝,24,PPT學(xué)習(xí)交流,(1) 溶解粗干擾素,配制純化緩沖液： 超純水，pH7.5磷酸緩沖液，

10、0.45 m濾器和10 ku超濾系統(tǒng)，百級(jí)層流下收集。冷卻至210。 檢查: 緩沖液的pH值和電導(dǎo)值。 溶解：210，勻漿，完全溶解。,25,PPT學(xué)習(xí)交流,(2) 沉淀與疏水層析,等電點(diǎn)沉淀（1）：磷酸調(diào)節(jié)至pH5.0，沉淀雜蛋白，離心收集上清液。 疏水層析：干擾素吸附在疏水層析柱中 除非疏水性蛋白 洗脫與收集：0.01M磷酸緩沖液（pH8.0）,26,PPT學(xué)習(xí)交流,等電點(diǎn)沉淀（2）：磷酸調(diào)節(jié)pH4.5，調(diào)節(jié)電導(dǎo)值40 ms/cm，210，靜置過夜 超濾：1000 ku超濾膜過濾，除去大蛋白。 透析除鹽：調(diào)整溶液pH 8.0，電導(dǎo)值，10 ku超濾膜，0.005 M緩沖液。,27,PPT學(xué)

11、習(xí)交流,(3)無菌過濾分裝,0.22 m濾膜過濾干擾素溶液 分裝 20以下的冰箱中保存。,28,PPT學(xué)習(xí)交流,(4)檢測項(xiàng)目,干擾素鑒別試驗(yàn) 干擾素效價(jià)測定 蛋白質(zhì)含量，純度測定，分子量 宿主殘余蛋白、殘余DNA 干擾素結(jié)構(gòu)鑒定：紫外光譜，肽譜，N端序列 其他：熱原，內(nèi)毒素，殘留抗生素,29,PPT學(xué)習(xí)交流,半成品檢定,（1）效價(jià)測定 用細(xì)胞病變抑制法，以Wish細(xì)胞、VSV病毒為基本檢測系統(tǒng)，測定中必須用國家或國際參考品校準(zhǔn)為國際單位。 （2）蛋白質(zhì)含量測定 福林-酚法，以中國藥品生物制品檢定所提供的標(biāo)準(zhǔn)蛋白為標(biāo)準(zhǔn)。 （3）比活性 效價(jià)的國際單位與蛋白質(zhì)含量的毫克數(shù)之比。 （4）純度 電泳

12、純度用非還原型SDS-PAGE法，銀染顯色應(yīng)為單一區(qū)帶，經(jīng)掃描儀測定純度應(yīng)在95%以上。,30,PPT學(xué)習(xí)交流,（5）相對(duì)分子量測定 還原型SDS-PAGE，加樣量不地域微克，同時(shí)用已知相對(duì)分子量的蛋白標(biāo)準(zhǔn)系列做對(duì)照，以遷移率為橫坐標(biāo)，相對(duì)分子量的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)作圖，計(jì)算相對(duì)分子量。與理論值比較，誤差不得高于10%。 （6）殘余外源性DNA含量測定 用放射性核素或生物素探針法測定，每劑量中殘余外源性DNA應(yīng)低于100pg。 （7）殘余血清IgG含量測定 在應(yīng)用抗體親和層析法作為純化方法時(shí)必須進(jìn)行此項(xiàng)檢定。 （8）殘余抗生素活性測定 半成品中不應(yīng)有抗生素活性存在。,31,PPT學(xué)習(xí)交流,（9）紫外

13、光譜掃描 檢查半成品的光譜吸收值，最大吸收值應(yīng)在2802納米。 （10）肽圖測定 用CNBr裂解法，測定結(jié)果應(yīng)符合干擾素的結(jié)構(gòu)，且批與批之間應(yīng)一致。 （11）等電點(diǎn)測定 等電聚焦電泳。 （12）除菌半成品應(yīng)做干擾素效價(jià)測定、無菌試驗(yàn)和熱源質(zhì)試驗(yàn)。,32,PPT學(xué)習(xí)交流,成品檢定,（1）物理性狀 凍干品白色或微黃色疏松體，加入注射水后不得含有肉眼可見不溶物。 （2）鑒別試驗(yàn) 應(yīng)用ELISA或中和試驗(yàn)檢定。 （3）水分測定 用卡氏法，應(yīng)低于3%。 （4）無菌試驗(yàn) 同半成品。,33,PPT學(xué)習(xí)交流,（5）熱原質(zhì)試驗(yàn) 同半成品檢定。 （6）干擾素效價(jià)測定 同半成品檢定，效價(jià)不應(yīng)低于標(biāo)示量。 （7）安全試驗(yàn) 取體重為350-400克豚鼠3只，每只腹側(cè)皮下注射量為成人每千克體重臨床使用最大量的3倍，觀察7天，若豚鼠局部無紅腫、壞死、總體重不下降，說明成品合格。 取體重18-20克小鼠5只，每只尾靜脈注射劑量按人每千克體重臨床使用最大量的3倍，觀察7天，若動(dòng)物全部存活，說明成品合格。,34,PPT學(xué)習(xí)交流,4 國內(nèi)基因工程藥物產(chǎn)業(yè)發(fā)展?fàn)顩r,我國的生物技術(shù)藥物卻一